摘要：共轭亚油酸(Conjugated pnoleic acid, CLA)是一类具有特殊生理活性的多不饱和脂肪酸。近年来的探讨已证实CLA对人体健康有多种益处,例如抗癌、抗粥样动脉硬化和减肥等功效。体内动物肿瘤实验和体外细胞培养实验表明,CLA能预防结肠肿瘤。CLA摄入后消化吸收历程中胃部低pH值环境会影响其活性,降低其抑制结肠癌LoVo细胞的活性。本课题选择了p-乳球蛋白作为载体物质来保护CLA的生理活性。β-乳球蛋白是牛乳清蛋白的重要组成成分,是由乳腺上皮细胞合成的乳特有的蛋白质。β-LG作为Lipocapn蛋白家族的成员,其蛋白质分子结构内部有一个特殊的可以与小疏水分子结合calyx结构,且p-乳球蛋白在体内不易被胃消化,这种耐受低pH,不易降解的特性使其成为口服结肠定位给药系统中理想的抗肿瘤药物缓释靶向载体之一。本探讨通过以下四个部分展开：(1)β-LG-CLA复合物的制备及稳定性浅析,综合采取热处理和滴定法制备β-LG-CLA复合物,并通过Delsa Nano Czeta(ζ)电位和粒径浅析仪检测模拟胃肠道pH环境作用下其粒径大小和ζ电位的变化,通过SDS-PAGE电泳检测模拟胃肠道酶环境作用下的稳定性,以此来探讨β-LG-CLA复合物靶向肠道历程中分子结构的稳定性；(2)LoVo细胞的形态学观察,倒置显微镜下观察不同浓度的β-LG-CLA复合物处理LoVo细胞后的形态学变化,初步判断复合物是否对LoVo细胞的增殖有影响；(3)p-LG-CLA复合物对LoVo细胞的增殖抑制和推动凋亡作用的探讨,用WST-1法检测细胞增殖抑制率；倒置显微镜观察细胞形态学变化；Hoechst33258荧光染色后在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率；(4)p-LG-CLA复合物推动LoVo(?)习胞凋亡信号传导机制的探讨,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的转变；caspase活性检测：western blot检测Cyt C表达量变化。通过以上探讨我们得到了以下结果：(1)将c9,t11-CLA逐滴加入到预热到50℃的β-LG溶液中,成功制备出β-LG-CLA复合物,利用Delsa Nano Czeta(ζ)电位和粒径浅析仪检测到β-LG-CLA复合物在胃pH环境下(pH1-3),β-LG-CLA复合物的ζ电位处于40mV至16mV之间；在肠道pH环境(pH6.0-7.4), β-LG-CLA复合物的ζ电位均低于-40mV,粒径大小分布在170nm左右。SDS-PAGE电泳检测发现在模拟胃肠道酶环境作用下β-LG-CLA复合物仅发生轻微的分解。(2)WST-1法检测β-LG-CLA复合物对LoVo细胞增殖抑制的实验结果表明：同一药物浓度的处理组随培养时间的延长对Lovo细胞增殖的抑制率增强,同一作用时间下随着药物浓度梯度增加对Lovo(?)田胞增殖的抑制率显著增强。(3)通过光学显微镜和荧光显微镜镜检LoVo细胞形态学变化发现：β-LG-CLA复合物不同浓度,不同作用时间下,LoVo (?)田胞均出现典型的凋亡形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率发现不同浓度的β-LG-CLA复合物处理组与对照组相比细胞凋亡率显著增加。(4)JC-1试剂盒检测发现LoVo细胞在不同浓度的β-LG-CLA复合物作用下线粒体膜电位有不同程度的降低,同时检测发现caspase的活性有不同程度的提升,线粒体中Cyt C的含量有不同程度的下降,相应的,胞浆中Cyt C蛋白有所增加。本课题利用β-LG分子结构calyx具有结合小疏水分子的特性,革新性以β-LG作为载体与CLA结合,合成了微米级的靶向肠道治疗肿瘤的物质,P-LG-CLA复合物的载体β-LG本身不具有毒害作用,同时也证实了合成的β-LG-CLA复合物在胃肠道pH环境和胃肠道酶作用下都较稳定,因而具有良好的靶向肠道治疗肿瘤的运用前景。本课题证实了不同浓度的β-LG-CLA复合物都具有抑制LoVo细胞增殖和推动其凋亡的作用,初步探讨了其作用机制可能是β-LG-CLA复合物作用细胞后刺激细胞导致线粒体膜电位下降,膜稳定性受到破坏,膜通透性发生转变,以而释放Cyt C等促凋亡因子,一步步激活Caspase级联反应下游的procaspase-3,进入线粒体和死亡受体凋亡途径的最后通路,最终导致细胞死亡。β-LG和CLA的联合运用为肿瘤的临床治疗开拓了新的途径,为开发出预防恶性肿瘤的功能性食品类的保健药物提供了一种新的思路。关键词：β-乳球蛋白论文共轭亚油酸论文Caspase-3论文细胞色素C论文凋亡论文LoVo细胞论文
摘要8-10
Abstract10-13
1 引言13-23
1.1 共轭亚油酸概述13-14
1.2 CLA治疗肠道癌症14
1.3 β-乳球蛋白的概述14-17
1.4 细胞凋亡与肿瘤发生17-18
1.5 线粒体途径细胞凋亡18-21
1.5.1 线粒体膜电位损伤18-19
1.5.2 Caspase蛋白家族19
1.5.3 细胞色素C19-21
1.6 课题探讨的目的与作用21-22
1.7 课题探讨内容22-23
2 材料与策略23-34
2.1 材料与设备23-27
2.1.1 细胞株23
2.1.2 试剂与培养基23-24
2.1.3 主要仪器设备和实验用液24-27
2.2 实验策略27-34
2.2.1 β-LG-CLA复合物的制备27
2.2.2 β-LG-CLA复合物在胃肠道中的稳定性27-28
2.2.3 细胞毒性实验筛选复合物作用浓度(WST-1法)28
2.2.4 比较β-LG、CLA、β-LG-CLA复合物对细胞增殖抑制率影响28-29
2.2.5 光学显微镜观察LoVo细胞形态29
2.2.6 Hoechst 33258荧光染色观察LoVo细胞核形态及凋亡小体29
2.2.7 流式细胞术检测LoVo细胞凋亡率29-30
2.2.8 荧光显微镜检测LoVo细胞膜电位变化30
2.2.9 测定Caspase-3蛋白活性30-31
2.2.10 Western blot法检测线粒体膜蛋白Cyt C表达31-33
2.2.11 统计学处理33-34
3 结果与浅析34-47
3.1 β-LG-CLA复合物在胃肠道中的稳定性34-36
3.1.1 β-LG-CLA复合物在胃肠道pH条件下的稳定性34
3.1.2 β-LG-CLA复合物在胃肠道酶作用下的稳定性34-36
3.2 β-LG-CLA对LoVo细胞的增殖抑制36-37
3.3 β-LG、CLA与β-LG-CLA对LoVo细胞的增殖抑制的比较37-38
3.4 光学显微镜下LoVo细胞形态观察38-39
3.5 荧光染色法观察LoVo细胞核形态及凋亡小体39-40
3.6 流式细胞仪测定LoVo细胞凋亡率40-42
3.7 JC-1染色检测线粒体膜电位变化42-43
3.8 β-LG-CLA对LoVo细胞内Caspase-3活性的影响43-44
3.9 绘制标准蛋白浓度曲线44-45
3.10 Western blot法检测Cyt C蛋白释放45-47
4 讨论47-52
4.1 β-LG-CLA复合物的制备与稳定性浅析47-48
4.2 β-LG-CLA对LoVo细胞增殖抑制作用48-49
4.3 β-LG-CLA复合物诱导LoVo细胞凋亡的作用机制49-50
4.4 β-LG-CLA对LoVo细胞CytC表达量的影响50-51
4.5 展望51-52
5 结论52-53
致谢53-54
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