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谈诱变基因组改组选育发酵木糖高产L乳酸米根霉菌株查抄袭率

收藏本文 2024-03-09 点赞:26092 浏览:112359 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:近年来随着粮食资源的日益紧张,开发利用可再生资源的呼声日渐高涨,以木质纤维素为原料生产L-乳酸成为L-乳酸发酵探讨的新热点。木糖是半纤维素的主要组成单糖,在木质纤维水解液中含量达到30%,仅次于葡萄糖位居第二,但野生米根霉菌株分解木糖产酸的能力较弱,选育高效利用木糖的米根霉菌株对木质纤维素生物转化生产L-乳酸具有重要作用。本论文采取基因组改组技术选育发酵木糖高产L-乳酸的米根霉菌株,探讨改组菌株、突变株、原始菌株的发酵特性及相关酶活,采取双向电泳技术对各菌株进行比较蛋白质组学浅析,初步探究改组菌株的性状改良机制。主要结果如下:(1)采取~(60)Co-γ射线对米根霉As3.819进行诱变处理,根据菌株致死率、正突变率与辐射剂量的联系,确定出最佳辐射剂量为400Gy,在此条件下对菌株进行反复诱变,筛选出L-乳酸产量提升且遗传稳定性良好的突变菌株mut-33和mut-43,其L-乳酸产量分别为46.85g/L和45.75g/L,较原始菌株分别提升了18.1%和15.3%。(2)对米根霉原生质体电融合条件进行了探讨,选用0.6mol/L山梨醇作为渗透压缓冲液,采取双亲灭活标记筛选融合子,亲本菌株mut-33的灭活条件为50℃加热6min,mut-43的灭活条件为紫外照射180s。通过单因素试验确定米根霉原生质体的电融合参数为直流脉冲电压2~(60)V,脉冲持续时间40μs,脉冲次数2次,融合率最高可达7.29%。(3)以突变株mut-33和mut-43为亲本,经两轮基因组改组筛选出性状优良的改组菌株F2-17,108h后其L-乳酸产量达到58.12g/L,与同批发酵的原始菌株相比,其发酵周期缩短24h,L-乳酸产量提升44.87%,L-乳酸得率提升28.80%。对原始菌株As3.819、突变株mut-33、第一轮改组菌株F1-19、第二轮改组菌株F2-17利用木糖产酸时的XR、XDH、LDH酶活进行浅析,结果表明:与原始菌株和亲本菌株相比,改组菌株的XR、XDH、LDH酶活均有显著的改善。(4)确定了米根霉菌体蛋白制备策略,可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。对原始菌株As3.819、突变株mut-33、改组菌株F1-19、F2-17的双向电泳图谱进行匹配浅析,确定出21个差别蛋白点,质谱鉴定出其中14个差别蛋白点。鉴定出的差别蛋白按照功能可以分为以下6类:①与丙酮酸胞质代谢相关的酶;②与柠檬酸循环相关的酶;③与糖酵解相关的酶;④热激蛋白;⑤细胞骨架蛋白;⑥与蛋白质合成相关的蛋白。(5)综合各差别蛋白点在各菌株中的表达量差别数据和质谱鉴定结果,对改组菌株的性状改良机制做出的初步推测为:菌株的ATP合酶表达量增加,合成更多的ATP,同时伴随NAD`+的大量生成,为XDH提供更多的辅酶,有利于菌株木糖利用能力的提升;糖酵解速率在一定程度上提升,推动了丙酮酸的生成,下游产物L-乳酸的生成速率也会随之提升;丙酮酸在其它分支途径中流量减少,更多的丙酮酸流入L-乳酸生成途径,使得菌株的L-乳酸产量增加。关键词:米根霉论文L-乳酸论文木糖论文基因组改组论文~(60)Co-γ射线诱变论文原生质体电融合论文双向电泳论文

    摘要5-7

    ABSTRACT7-9

    致谢9-15

    第一章 绪论15-27

    1.1 乳酸的性质与运用15-16

    1.1.1 乳酸的结构与性质15

    1.1.2 乳酸的运用15-16

    1.2 米根霉利用木质纤维素发酵产 L-乳酸探讨进展16-17

    1.3 微生物的木糖代谢探讨进展17-19

    1.3.1 微生物的木糖代谢途径17-18

    1.3.2 木糖的运输18

    1.3.3 木糖代谢基因工程菌的构建18-19

    1.4 基因组改组技术19-22

    1.4.1 基因组改组技术的原理和优势19-21

    1.4.2 基因组改组技术的运用近况21-22

    1.5 双向电泳技术22-24

    1.5.1 双向电泳技术的原理22-23

    1.5.2 双向电泳技术在微生物学中的运用近况23-24

    1.6 本课题探讨的目的、作用及主要内容24-27

    1.6.1 本课题探讨的目的、作用24-25

    1.6.2 本课题探讨的主要内容25-26

    1.6.3 本论文的探讨框架图26-27

    第二章 木糖发酵 L-乳酸高产菌株的~(60)Co-γ射线诱变选育27-35

    2.1 材料与策略27-30

    2.1.1 菌种与试剂27-28

    2.1.2 仪器与设备28

    2.1.3 培养基28

    2.1.4 培养策略28-29

    2.1.5 检测策略29-30

    2.2 实验案例30-31

    2.2.1 菌株的活化30

    2.2.2 单孢子悬液的制备30

    2.2.3 ~(60)Co-γ射线诱变处理30

    2.2.4 诱变效果的计算30-31

    2.2.5 高产突变株的筛选31

    2.2.6 高产突变株的遗传稳定性考察31

    2.3 结果与浅析31-34

    2.3.1 ~(60)Co-γ射线对米根霉的诱变效应31-32

    2.3.2 木糖发酵 L-乳酸高产突变株的筛选32-33

    2.3.3 高产突变株的遗传稳定性33-34

    2.4 本章小结34-35

    第三章 米根霉原生质体电融合条件探讨35-45

    3.1 材料与策略35-37

    3.1.1 菌种与试剂35-36

    3.1.2 仪器与设备36

    3.1.3 培养基36

    3.1.4 混合酶液36

    3.1.5 电融合缓冲液36

    3.1.6 孢子斜面培养策略36

    3.1.7 菌悬液的制备策略36

    3.1.8 原生质体的制备、再生及电融合策略36-37

    3.2 实验案例37-39

    3.2.1 不同的渗透压缓冲液对原生质体制备及再生的影响37

    3.2.2 原生质体排队现象的观察37-38

    3.2.3 原生质体灭活条件的选择38

    3.2.4 原生质体电融合参数的选择38-39

    3.3 结果与浅析39-44

    3.3.1 渗透压缓冲液对原生质体制备及再生的影响39-40

    3.3.2 原生质体排队现象的观察40-41

    3.3.3 原生质体灭活条件的选择41-42

    3.3.4 电融合参数的选择42-44

    3.4 本章小结44-45

    第四章 基因组改组选育木糖发酵 L-乳酸高产菌株45-58

    4.1 材料与策略45-50

    4.1.1 菌种与试剂45-46

    4.1.2 仪器与设备46

    4.1.3 培养基46

    4.1.4 培养策略46-47

    4.1.5 原生质体的制备、灭活及电融合策略47

    4.1.6 检测策略47-50

    4.2 实验案例50-51

    4.2.1 第一轮基因组改组50-51

    4.2.2 第二轮基因组改组51

    4.2.3 改组菌株、突变株和原始菌株的发酵特性比较51

    4.2.4 改组菌株、突变株和原始菌株的 XR、XDH、LDH 酶活比较51

    4.3 结果与浅析51-57

    4.3.1 木糖发酵 L-乳酸高产菌株的基因组改组选育51-54

    4.3.2 改组菌株、突变株和原始菌株的发酵特性比较54-56

    4.3.3 改组菌株、突变株和原始菌株的 XR、XDH、LDH 酶活比较56-57

    4.4 本章小结57-58

    第五章 改组菌株、突变株、原始菌株的比较蛋白质组学探讨58-78

    5.1 材料与策略58-65

    5.1.1 菌种与试剂58-59

    5.1.2 仪器与设备59

    5.1.3 溶液的配制59-60

    5.1.4 蛋白样品的制备策略60-61

    5.1.5 蛋白质浓度的测定61

    5.1.6 双向电泳操作策略61-65

    5.2 实验案例65

    5.2.1 蛋白溶解液的确定65

    5.2.2 改组菌株、突变株、原始菌株双向电泳图谱的比对浅析65

    5.2.3 差别蛋白点的鉴定65

    5.3 结果与浅析65-77

    5.3.1 蛋白溶解液的选择65-67

    5.3.2 改组菌株、突变株、原始菌株双向电泳图谱的比对浅析67-75

    5.3.3 差别蛋白点的鉴定75-77

    5.4 本章小结77-78

    第六章 结论与展望78-80

    6.1 结论78-79

    6.2 展望79-80

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