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摘要：目的：利用除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破骨细胞形成系)及小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系分别诱导培养破骨前驱细胞及成熟破骨细胞，探讨大黄酸对两种体外培养的破骨细胞形成及分化的影响，观察破骨细胞早期阶段及成熟阶段的形态学变化，为预防和治疗破骨细胞性骨吸收性疾病提供一种新制剂。策略：选用两种细胞培养系：除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破骨细胞形成系)及小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系，进行体外破骨细胞诱导培养，分别观察大黄酸对破骨前驱细胞及成熟破骨细胞形成、分化的影响。1细胞培养及药物添加：1.1前破骨细胞形成系：取4周龄SD雄性大鼠一只(80-120g),用异氟烷麻醉后,在无菌条件下取其胫骨和股骨，去掉骨垢端暴露骨髓腔,然后用10ml无菌注射器抽取不含血清的α-MEM培养液冲洗骨髓腔，制取全骨髓细胞,1500转/分离心5分钟后,弃去上清液,加入含15%胎牛血清的α-MEM培养液20ml，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，此为全骨髓细胞悬液，经过离心浓缩成2ml,然后注入葡聚糖凝胶柱G10(Sephadex G10)中过滤，除去骨髓间质细胞，搜集非附着性骨髓细胞10-12ml,利用细胞计数板,计算细胞数，然后配制浓度为2×106cells/ml的细胞悬液13ml，添加破骨细胞分化因子(sRANKL)和活化型双羟维生素D3(1α，25(OH)2D3)，使其终浓度分别为40ng/ml和10-8Mol/ml，将细胞悬液播种于24孔培养板中，每孔加入细胞悬液0.5ml(1×106cells)。然后将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养，培养至第4天时更换培养液一次，共计培养7天。1.2小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系：以液氮罐中取出RAW264.7细胞株，放入37℃水浴箱中快速复苏，用无菌吸管将细胞液移至15ml离心管内，吸取生理盐水洗涤冻存管两次，一并将其移至上面陈述的离心管中，上离心机，1000转/分离心5分钟后，弃去上清液,加入含10%胎牛血清的1640培养液约10ml，充分吹打混匀形成单细胞悬液，根据实验要求培养细胞。当细胞生长状态良好，长满瓶底壁约90%时进行消化，收集细胞，1000转/分离心5分钟后，弃去上清液,加入含10%胎牛血清的1640培养液约10ml，充分吹打混匀形成单细胞悬液，利用细胞计数板，计算细胞数，然后配制成浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液5ml，添加破骨细胞分化因子(sRANKL)50ng/ml，播种细胞于96孔培养板中，利用24孔，共4行6列，每孔加入细胞悬液150μl，然后将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养，培养4~5天。1.3药物添加：在4行6列的24孔培养板中添加药物大黄酸,使其终浓度分别为0、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L,每个浓度每列4孔(n＝4)，第一列为对照组。在96孔培养板中选择24个孔，使其呈4行6列，添加药物大黄酸，使其终浓度分别为0、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L,每个浓度每列4孔(n＝4)，第一列为对照组。2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：破骨前驱细胞培养系培养至第7天及RAW264.7细胞培养系培养至第5天后行TRAP染色，倒置光镜下观察，计算并记录染色阳性细胞数。3统计学浅析：利用SPSS13.0软件进行统计学浅析。数据处理采取mean±SD检验浅析，数据资料采取Student’s t-test和非参数检验的方差浅析，各不同浓度的加药组与对照组之间相比较。结果：1前破骨细胞形成系：1.1破骨前驱细胞的形态学特点经TRAP染色后，可见到大量染色阳性的破骨前驱细胞，其形态学特点与成熟破骨细胞相似，但是细胞体积较小，形态多样(见Fig.1)，可呈椭圆形、类圆形、四边形、条索状和不规则形等。细胞大多为单核，也可见到2核者。1.2大黄酸对破骨前驱细胞形成的抑制在前破骨细胞形成系中，10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L组与对照组相比，TRAP染色阳性细胞(单核或2核)数仅为对照组的4.98%、12.27%、18.57%、34.14%、78.57%。经统计学浅析，加药组对破骨前驱细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为10-3mol/L时，与对照组相比,对破骨前驱细胞的形成有显著抑制(p﹤0.05)(见Fig.3和Table1)。2RAW264.7细胞培养系：2.1破骨细胞样细胞(成熟破骨细胞)的形态学特点经TRAP染色后，可见到大量破骨细胞样细胞，其形态学特点与成熟破骨细胞相似，细胞体积较大，形态多样(见Fig.5)，可呈星形、圆形、类圆形、梭形、条索状及不规则形。细胞核为多个。2.2大黄酸对破骨细胞样细胞形成的抑制在RAW264.7细胞培养系中,10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L组与对照组相比，TRAP染色阳性细胞数仅为对照组的4.36%、63.39%、72.73%、81.94%、92.73%。经统计学浅析，加药组对破骨细胞样细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为10-3mol/L时，与对照组相比,对破骨细胞样细胞的形成有显著抑制(p﹤0.05)(见Fig.6和Table2)。结论：1大黄酸能抑制破骨前驱细胞及成熟破骨细胞的形成与分化。2大黄酸对破骨细胞的抑制作用在一定浓度范围内具有浓度依赖性。关键词：大黄酸论文破骨细胞论文破骨前驱细胞论文RAW264.7细胞论文细胞培养论文破骨细胞分化因子论文
摘要4-7
ABSTRACT7-11
前言11
材料与策略11-19
结果19-20
附图20-23
附表23-24
讨论24-26
结论26-27