摘要：pH值调节法（pH-shifting，酸/碱溶解-等电点沉淀法）是一种新型的动物蛋白质提取策略，在低温偏离蛋白质等电点的极端酸性（pH≤3.0）或极端碱性（pH≥11.0）条件下使蛋白充分溶解，高速离心除去脂肪和不溶性杂质制备可溶性蛋白溶液，然后在等电点条件下使蛋白沉淀并回收，制备鱼分离蛋白（Fish Protein Isolates，FPI）。由于酸/碱法提取蛋白质回收率高、脂肪含量低、环境的污染小、凝胶强度好、色泽较好且具有较好的贮藏稳定性而受到广泛的关注，但提取历程中蛋白质结构和性质变化的探讨相对较少，如不同阴阳离子的选择对pH值调节法的影响以及酸碱调节处理对肌球蛋白的结构-功能的影响。为此，本探讨以罗非鱼肉为原料，提取肌球蛋白，探讨pH值调节处理历程中，肌球蛋白分子酸/碱去折叠、等电点和中性调节重折叠历程中分子结构和性质的变化。其主要目的是进一步了解pH值调节处理历程中分子构象的动态变化，改善其基础论述系统，为低值海洋蛋白制备技术系统的建立和新型功能性分离鱼蛋白的开发提供依据。主要探讨结果如下：1.采取pH值调节（pH2.0-5.5、3.0-5.5、11.0-5.5、12.0-5.5）处理制备四种鱼分离蛋白，分别提取其水溶性组分和盐溶性组分，对其组成、溶解性、表面疏水性、总巯基和活性巯基含量、色氨酸荧光光谱、SDS-PAGE等进行检测和浅析。结果表明：分离蛋白中盐溶性组分比例高于水溶性组分比例（p0.05），且碱提蛋白中盐溶性蛋白的比例比酸提蛋白高（p0.05）,表明碱法更易蛋白的提取；分离蛋白中水溶性组分和盐溶性组分的溶解性均受pH值的影响比较显著，酸提蛋白的溶解性较碱提蛋白的低；与新鲜鱼肉蛋白相比，四种分离蛋白中水溶性组分和盐溶性组分均发生了变性，系统的表面疏水性增加、巯基含量降低、色氨酸荧光强度下降，且酸性条件下蛋白质发生变性更严重；SDS-PAGE浅析表明，肌球蛋白的变性最为显著。总体浅析可得，碱调节处理更有利于蛋白的提取。2.以罗非鱼肌球蛋白为原料，试验不同的pH值和酸/碱类型对肌球蛋白酸/碱溶解去折叠历程中分子结构和性质的变化。探讨表明：在广泛pH值（pH2.0-12.0）范围内，肌球蛋白的溶解性受pH影响较显著；在极端酸性（pH≤3.0）和碱性（pH≥11.0）条件下，肌球蛋白的溶解度为60.6%~76.65%，而在pH4.0~6.0时溶解度较低；酸/碱诱导肌球蛋白去折叠历程中，在偏离pH7.0时，肌球蛋白的表面疏水性逐渐增大、巯基含量逐渐减小、色氨酸荧光强度减弱、Ca~(2+)-ATPase活性减小，这表明肌球蛋白疏水基团暴露、分子结构发生变化，且肌球蛋白在碱性条件变性程度较酸性条件下弱;在pH7.0条件下处理时，Ca~(2+)-ATPase活性为0.19μmol/mg/min，肌球蛋白变性程度较弱。3.采取不同种类的酸诱导肌球蛋白去折叠，在HCl（pH2.0）处理条件下，表面疏水性最大、巯基含量最低、色氨酸荧光强大最小，肌球蛋白构象变性较严重，而在C_6H_8O_7（pH3.0）处理条件下，肌球蛋白构象变化程度最弱；肌球蛋白在C_6H_8O_7和H_O_4（pH2.0）处理条件下，-螺旋比例分别为20.5%和9%；不同种类的碱诱导肌球蛋白去折叠，NaOH（pH11.0）处理条件下的表面疏水性最小、巯基含量最高、色氨酸荧光强度最大、-螺旋比例最高，肌球蛋白构象变化程度最弱，此时肌球蛋白总巯基、活性巯基含量和-螺旋比例分别为4.054mol/10~5g、1.308mol/10~5g和15.3%。总体浅析可得，肌球蛋白在C_6H_8O_7（pH3.0）、NaOH（pH11.0）诱导下变性程度最弱。4.进一步探讨酸/碱去折叠历程中NaCl的添加浓度和顺序对罗非鱼肌球蛋白结构和性质的影响，探讨表明，添加0.5mol/L的NaCl时，肌球蛋白的溶解性最好；肌球蛋白在C_6H_8O_7诱导去折叠历程中，NaCl的添加对疏水性影响不显著（p0.05）；但用H_O_4、NaOH、KOH诱导去折叠时，在去折叠之前加NaCl时疏水性指数最小、巯基含量最高、荧光强大最大，且去折叠前加NaCl，肌球蛋白在C_6H_8O_7、H_O_4（pH2.0）和NaOH、KOH（pH11.0）条件下，-螺旋比例分别为47.9%、30.1%、38.4%和26.2%；去折叠后加NaCl，-螺旋含量比例分别为31.2%、8.2%、13.1%和10.1%；这表明在用酸碱处理肌球蛋白溶液之前加NaCl能够抑制其构象的变化。总体浅析可得，酸碱对肌球蛋白构象的影响程度为：弱酸（C_6H_8O_7）＜强酸（H_O_4），NaOH＜KOH。5.将酸/碱变性肌球蛋白调节到中性，考察重折叠历程性肌球蛋白结构和性质的变化。探讨表明：未经酸/碱诱导重折叠的肌球蛋白溶解性显著高于经过酸/碱诱导重折叠的肌球蛋白溶解性，这表明经过酸/碱诱导处理后，肌球蛋白发生变性；碱性条件（尤其是pH11.0）下处理的肌球蛋白溶解性在广泛pH值（pH2.0-12.0）范围内最好；与酸/碱去折叠肌球蛋白相比，经过酸/碱诱导重折叠后的变性肌球蛋白表面疏水性降低、巯基含量和Ca~(2+)-ATPase活性增大、荧光强大增强，这表明酸/碱诱导部分变性的肌球蛋白发生了重折叠。6.采取不同种类的酸和碱诱导变性肌球蛋白重折叠，探讨表明，碱调节不同种类的酸变性肌球蛋白，对H_O_4（pH11.0）去折叠的变性肌球蛋白，经碱调节重折叠后-螺旋比例为26.4%，肌球蛋白构象变性较轻，而在HCl（pH2.0）去折叠的变性肌球蛋白，-螺旋比例为14.9%，肌球蛋白构象变化程度最严重；酸调节不同种类的碱变性肌球蛋白，NaOH（pH11.0）诱导去折叠的肌球蛋白构象变性较轻，而在KOH（pH12.0）诱导去折叠处理条件下，肌球蛋白构象变化程度最严重。与去折叠肌球蛋白相比，经pH值调节诱导重折叠后表面疏水性降低、巯基含量增大、荧光强大增强、-螺旋比例增大，这表明当把pH调回到中性时，部分变性的肌球蛋白发生重折叠。通过考查NaCl的添加顺序在酸/碱重折叠历程中对变性肌球蛋白构象的影响，探讨表明，去折叠之前加NaCl时疏水性较小、巯基含量较高、-螺旋比例较高。总体探讨显示，酸/碱法提取蛋白质历程中肌球蛋白分子构象发生转变，采取C_6H_8O_7和NaOH诱导肌球蛋白去折叠，肌球蛋白变性展开，且构象变化程度最小；随后调节pH到中性时，部分变性的肌球蛋白重折叠恢复到原有的结构；酸/碱提取蛋白质历程中，在去折叠之前添加NaCl，能够抑制蛋白质分子构象的变化。关键词：罗非鱼论文肌球蛋白论文pH调节法论文去折叠论文重折叠论文构象论文
摘要4-7
Abstract7-12
1 绪论12-20
1.1 我国罗非鱼生产加工利用的近况12-13
1.2 水产蛋白加工利用近况13-15
1.2.1 水洗法13
1.2.2 有机溶剂萃取法13-14
1.2.3 酶解法14
1.2.4 pH 值调节法14-15
1.3 pH 值调节处理对肌球蛋白结构和性质的影响探讨15-18
1.3.1 肌球蛋白介绍15-17
1.3.2 肌球蛋白酸/碱去折叠历程中构象与性质的变化17
1.3.3 酸/碱变性肌球蛋白重折叠历程中构象与性质的变化17-18
1.4 本探讨目的与作用18-19
1.5 本探讨主要内容19-20
2 pH 值调节处理历程中罗非鱼肌肉蛋白结构和性质的变化20-33
2.1 引言20-21
2.2 实验材料与仪器21-22
2.2.1 材料与试剂21
2.2.2 设备与仪器21-22
2.3 实验策略22-25
2.3.1 实验流程22
2.3.2 罗非鱼分离蛋白的制备22-23
2.3.3 水溶性和盐溶性蛋白的提取23
2.3.4 溶解度的测定23
2.3.5 表面疏水性的测定23-24
2.3.6 总巯基和活性巯基含量的测定24
2.3.7 色氨酸荧光的测定24
2.3.8 SDS-PAGE 电泳24-25
2.4 结果与浅析25-32
2.4.1 pH 值对罗非鱼肉及其分离蛋白溶解性的影响25-26
2.4.2 罗非鱼肉及其分离蛋白的蛋白组成浅析26-27
2.4.3 罗非鱼肉及其分离蛋白的表面疏水性浅析27-28
2.4.4 罗非鱼肉及其分离蛋白的巯基含量浅析28-29
2.4.5 罗非鱼肉及其分离蛋白的色氨酸荧光光谱浅析29-31
2.4.6 罗非鱼肉及其分离蛋白的 SDS-PAGE电泳浅析31-32
2.5 本章小结32-33
3 酸/碱诱导肌球蛋白去折叠分子结构和性质的变化33-58
3.1 引言33-34
3.2 实验材料与仪器34-35
3.2.1 材料与试剂34
3.2.2 设备与仪器34-35
3.3 实验策略35-37
3.3.1 实验流程35-36
3.3.2 样液的制备36
3.3.3 SDS-PAGE 电泳36
3.3.4 溶解度的测定36-37
3.3.5 表面疏水性的测定37
3.3.6 Ca~(2+)-ATPase 活性的测定37
3.3.7 总巯基与活性巯基的测定37
3.3.8 色氨酸荧光的测定37
3.3.9 圆二色谱的测定37
3.4 结果与浅析37-56
3.4.1 罗非鱼肌球蛋白的提取和纯度浅析37-38
3.4.2 pH 值对肌球蛋白酸/碱去折叠分子结构和性质的影响38-41
3.4.3 不同种类的酸诱导肌球蛋白去折叠分子结构和性质的变化41-44
3.4.4 不同种类的碱诱导肌球蛋白去折叠分子结构和性质的变化44-46
3.4.5 NaCl 的添加量对肌球蛋白分子结构和性质的影响46-48
3.4.6 NaCl 的添加顺序对酸诱导肌球蛋白去折叠分子结构和性质的影响48-52
3.4.7 NaCl 的添加顺序对碱诱导肌球蛋白去折叠分子结构和性质的影响52-56
3.5 本章小结56-58
4 pH 值调节诱导酸/碱变性肌球蛋白重折叠分子结构和性质的变化58-75
4.1 引言58-59
4.2 实验材料和仪器59
4.2.1 材料与试剂59
4.2.2 设备与仪器59
4.3 实验策略59-60
4.3.1 样液的制备59-60
4.3.2 溶解度的测定60
4.3.3 表面疏水性的测定60
4.3.4 Ca~(2+)-ATPase 活性的测定60
4.3.5 总巯基与活性巯基的测定60
4.3.6 色氨酸荧光的测定60
4.3.7 圆二色谱的测定60
4.4 结果与浅析60-73
4.4.1 pH 值对酸/碱变性肌球蛋白分子结构和性质的影响60-64
4.4.2 碱诱导不同种类酸变性肌球蛋白重折叠结构和性质的变化64-67
4.4.3 酸诱导不同种类碱变性肌球蛋白重折叠结构和性质的变化67-70
4.4.4 NaCl 添加顺序对酸/碱变性肌球蛋白重折叠分子结构和性质的影响70-73
4.5 本章小结73-75
5 全文结论、革新点与展望75-78
5.1 全文总结与革新点75-76
5.2 展望76-78
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