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摘要：目的 建立滋阴明目片的质量标准。策略 采用薄层色谱法对滋阴明目片中的牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对丹参中的丹酚酸B进行含量测定。色谱柱为Kromasil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水（24∶10∶66）为流动相，检测波长为286 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30 ℃。结果 在薄层色谱中可检出牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲的特征斑点，且斑点清晰，易于观察。丹酚酸B的进样量在0.32～1.92 μg范围内线性关系良好，r=0.999 9（n=5），平均加样回收率为99.91%，RSD=0.63%（n=6）。结论 该法专属性强，重复性好，结果准确，可用于滋阴明目片的质量制约。
关键词：滋阴明目片；质量标准；丹酚酸B；薄层色谱法；高效液相色谱法
滋阴明目方是湖南中医药大学第一附属医院眼科协定处方制剂，由山萸肉、熟地黄、黄精、牡丹皮等药材组成，具有滋阴、活血、利水的功效，临床用于原发性视网膜色素变性等眼疾疗效显著[1-2]。滋阴明目片是由滋阴明目丸改剂型而成，为制约滋阴明目片的质量，确保其临床疗效，本研究采用薄层色谱法对方中牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，高效液相色谱法对方中丹参的主要成分丹酚酸B进行含量测定。
牡丹皮对照药材（批号121521-200504）、山萸肉对照药材（批号121528-200408）、羌活对照药材（批号121362-200407）、石菖蒲对照药材（批号121536- 200502）、丹酚酸B对照品（批号MUST-12020104），均由中国药品生物制品检定所提供。滋阴明目方药材（湖南中医药大学第一附属医院采购，批号20120615，经刘绍贵教授鉴定均符合药典标准）。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2.1.2 山萸肉 取本品样品3.0 g，研细，加乙酸乙酯20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加2 mL无水乙醇溶解作为供试品溶液。取缺山萸肉的阴性样品3.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g山萸肉对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]26，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.3 羌活 取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解作为供试品溶液。取缺羌活的阴性样品4.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g羌活对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]170，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯（16∶8∶8）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，置365 nm紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.4 石菖蒲 取取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL石油醚溶解作为供试品溶液。取缺石菖蒲的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g石菖蒲对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]85，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（20∶5）为展开剂，展开、取出、晾干，放置1 h，置于365 nm紫外灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.2.2 对照品溶液制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解，定容，制得每1 mL含丹酚酸B 0.16 mg的对照品溶液。2.2.3 供试品溶液制备 取滋阴明目片3片，研细，取0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷后定容至刻度，滤过，续滤液作为供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺丹参的其余药味，按制备工艺要求制成不含丹参的阴性对照制剂，以供试品溶液制备的策略制备阴性对照溶液。
2.2.5 阴性干扰试验 取对照品类风湿关节炎患者雷公藤甲素血清浓度测定及其药动学相关论文由www.udooo.com收集溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，结果在丹酚酸B色谱峰位置处无相应峰出现，表明方中其他药味对丹酚酸B的测定无干扰。色谱图见图2。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL分别进样，测定峰面积。以峰面积值对进样量进行线性回归，得回归方程Y=1035.6X-20.733，r=0.999 9（n=6）。丹酚酸B进样量在0.32～
3 讨论
滋阴明目片中丹参活血袪瘀，协助君药补肾养阴、益肝明目，共奏滋补肝肾、活血化瘀之功。丹酚酸B为丹参中的有效成分之一，因此，笔者以丹酚酸B的含量作为滋阴明目片的质量制约指标，参考有关文献[4-6]建立了HPLC测定本品中丹酚酸B含量的策略。
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中测丹参中丹酚酸B含量的流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），在此流动相比例下丹酚酸B出峰时间过早，与其他峰不能很好分离，故将比例调整为甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；而且在试验中，比较了分别用60%、70%、80%的甲醇超声提取30 min或者加热回流1 h的样品处理策略，结果发现，加热回流1 h制备的供试品溶液中的丹酚酸B含量稍高于用超声提取30 min制备的供试品溶液，但差别不大，其中用80%的甲醇提取的浓度最高，考虑到超声提取策略简便、节能，故确定用80%的甲醇超声提取30 min。上述策略能将样品中的杂质与丹酚酸B分离开，且稳定可靠、准确，重复性好，可用于滋阴明目片的质量制约。
滋阴明目片中的山萸肉、羌活、石菖蒲药材均采用2010年版《中华人民共和国药典》的薄层色谱法鉴别，结果表明山萸肉、羌活、石菖蒲的阴性无干扰。牡丹皮的薄层鉴别则先采用药典策略，药材无斑点，后将制备过程中的提取换成乙醇提取，则能得到明显橘斑点，阴性无干扰。以上4味药材的鉴别可作为滋阴明目片的质量标准。
参考文献：
[1] 艾明，孙明，李岱.视网膜色素变性的治疗进展[J].国际眼科杂志， 2010，10（7）：1324-1326.
[2]何文安，张虎，代丽华，等.视网膜色素变性的研究进展[J].基层医学论坛，2008，12（35）：1132-1133.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[4] 蒋桂香，吕应年，范世锦，等.浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量制约研究[J].中国医药导报，2011，8（34）：67-69.
[5] 吕鹏，张振凌，杨锁成.HPLC测定复方丹参降浊丸中丹酚酸B的含量[J].中国中医药现代远程教育，2011，9（21）：134-135.
[6] 刘亚英，梁敏，杜艳玲，等.HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B的含量[J].中国药师，2011，14（10）：1469-1471.
关键词：滋阴明目片；质量标准；丹酚酸B；薄层色谱法；高效液相色谱法
滋阴明目方是湖南中医药大学第一附属医院眼科协定处方制剂，由山萸肉、熟地黄、黄精、牡丹皮等药材组成，具有滋阴、活血、利水的功效，临床用于原发性视网膜色素变性等眼疾疗效显著[1-2]。滋阴明目片是由滋阴明目丸改剂型而成，为制约滋阴明目片的质量，确保其临床疗效，本研究采用薄层色谱法对方中牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，高效液相色谱法对方中丹参的主要成分丹酚酸B进行含量测定。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），KQ-600型超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂），AR2140电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。牡丹皮对照药材（批号121521-200504）、山萸肉对照药材（批号121528-200408）、羌活对照药材（批号121362-200407）、石菖蒲对照药材（批号121536- 200502）、丹酚酸B对照品（批号MUST-12020104），均由中国药品生物制品检定所提供。滋阴明目方药材（湖南中医药大学第一附属医院采购，批号20120615，经刘绍贵教授鉴定均符合药典标准）。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 策略与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 牡丹皮 取本品样品6.0 g，研细，加无水乙醇超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，滤过，滤液挥干，加2 mL丙酮溶解类风湿关节炎患者雷公藤甲素血清浓度测定及其药动学相关论文由www.udooo.com收集作为供试品溶液。取不含牡丹皮的阴性样品6.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取丹皮对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]160，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出、晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），于105 ℃烘箱加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色橘荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。2.1.2 山萸肉 取本品样品3.0 g，研细，加乙酸乙酯20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加2 mL无水乙醇溶解作为供试品溶液。取缺山萸肉的阴性样品3.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g山萸肉对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]26，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.3 羌活 取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解作为供试品溶液。取缺羌活的阴性样品4.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g羌活对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]170，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯（16∶8∶8）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，置365 nm紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.4 石菖蒲 取取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL石油醚溶解作为供试品溶液。取缺石菖蒲的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g石菖蒲对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]85，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（20∶5）为展开剂，展开、取出、晾干，放置1 h，置于365 nm紫外灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Kromasil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；检测波长：286 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；理论塔板数按丹酚酸B峰计算不低于2000。2.2.2 对照品溶液制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解，定容，制得每1 mL含丹酚酸B 0.16 mg的对照品溶液。2.2.3 供试品溶液制备 取滋阴明目片3片，研细，取0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷后定容至刻度，滤过，续滤液作为供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺丹参的其余药味，按制备工艺要求制成不含丹参的阴性对照制剂，以供试品溶液制备的策略制备阴性对照溶液。
2.2.5 阴性干扰试验 取对照品类风湿关节炎患者雷公藤甲素血清浓度测定及其药动学相关论文由www.udooo.com收集溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，结果在丹酚酸B色谱峰位置处无相应峰出现，表明方中其他药味对丹酚酸B的测定无干扰。色谱图见图2。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL分别进样，测定峰面积。以峰面积值对进样量进行线性回归，得回归方程Y=1035.6X-20.733，r=0.999 9（n=6）。丹酚酸B进样量在0.32～
1.92 μg范围内线性关系良好。
2.2.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液在拟订的色谱条件下重复进样6次，结果峰面积的RSD=1.91%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配置后0、1、2、4、8 h进样，测定丹酚酸B的峰面积，结果峰面积的RSD=1.36%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取批号为20120816的样品，平行制备6份供试品溶液，并依法测定丹酚酸B的含量。结果丹酚酸B的平均含量为1.79 mg/g，RSD=24%，表明该策略重复性好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取6份批号为20120816的样品，分别加入丹酚酸B对照品适量，按“2.2.3”项下策略制备并测定，结果见表1。3 讨论
滋阴明目片中丹参活血袪瘀，协助君药补肾养阴、益肝明目，共奏滋补肝肾、活血化瘀之功。丹酚酸B为丹参中的有效成分之一，因此，笔者以丹酚酸B的含量作为滋阴明目片的质量制约指标，参考有关文献[4-6]建立了HPLC测定本品中丹酚酸B含量的策略。
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中测丹参中丹酚酸B含量的流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），在此流动相比例下丹酚酸B出峰时间过早，与其他峰不能很好分离，故将比例调整为甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；而且在试验中，比较了分别用60%、70%、80%的甲醇超声提取30 min或者加热回流1 h的样品处理策略，结果发现，加热回流1 h制备的供试品溶液中的丹酚酸B含量稍高于用超声提取30 min制备的供试品溶液，但差别不大，其中用80%的甲醇提取的浓度最高，考虑到超声提取策略简便、节能，故确定用80%的甲醇超声提取30 min。上述策略能将样品中的杂质与丹酚酸B分离开，且稳定可靠、准确，重复性好，可用于滋阴明目片的质量制约。
滋阴明目片中的山萸肉、羌活、石菖蒲药材均采用2010年版《中华人民共和国药典》的薄层色谱法鉴别，结果表明山萸肉、羌活、石菖蒲的阴性无干扰。牡丹皮的薄层鉴别则先采用药典策略，药材无斑点，后将制备过程中的提取换成乙醇提取，则能得到明显橘斑点，阴性无干扰。以上4味药材的鉴别可作为滋阴明目片的质量标准。
参考文献：
[1] 艾明，孙明，李岱.视网膜色素变性的治疗进展[J].国际眼科杂志， 2010，10（7）：1324-1326.
[2]何文安，张虎，代丽华，等.视网膜色素变性的研究进展[J].基层医学论坛，2008，12（35）：1132-1133.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[4] 蒋桂香，吕应年，范世锦，等.浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量制约研究[J].中国医药导报，2011，8（34）：67-69.
[5] 吕鹏，张振凌，杨锁成.HPLC测定复方丹参降浊丸中丹酚酸B的含量[J].中国中医药现代远程教育，2011，9（21）：134-135.
[6] 刘亚英，梁敏，杜艳玲，等.HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B的含量[J].中国药师，2011，14（10）：1469-1471.