探究洛伐他汀洛伐他汀联合厄贝沙坦对梗阻性肾病大鼠骨桥蛋白与肾间质纤维化影响

[摘要] 目的 探讨洛伐他汀联合厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠骨桥蛋白（OPN）表达及肾间质纤维化的影响。 方法 将试验用SD大鼠随机分为4组（n = 10）：检测手术对照组、单侧输尿管结扎组（UUO组）、厄贝沙坦组（60 mg/L）、联合治疗组（洛伐他汀20 mg/L联合厄贝沙坦60 mg/L）。对照组及模型组仅予等量生理盐水灌胃。观察各组大鼠第6周肾功能、24 h尿蛋白和肾组织病理学改变，并检测肾组织骨桥蛋白的表达。 结果 与模型组比较，厄贝沙坦治疗能使OPN的表达降低（P < 0.05），使24 h尿蛋白及血清肌酐（Scr）降低（P < 0.05），肾组织病理损害减轻，肾小管间质面积较模型组显著减少（P < 0.01）；而洛伐他汀联合厄贝沙坦治疗后，OPN的表达降低更为显著，肾功能及肾组织病理损害改善更为明显。 结论 洛伐他汀联合厄贝沙坦可明显降低单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质OPN的表达，减轻肾小管间质纤维化而发挥肾脏保护作用。
[关键词] 洛伐他汀；厄贝沙坦；骨桥蛋白；肾间质纤维化
[] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（c）-0009-03
Effect of union treatment of lovastatin and irbesartan on osteopontin expression and tubulointerstitial fibrosis in obstructive nephropathy rats
YANG Xia SUN Zhaolin▲ YUAN Jing ZHA Yan HE Pinghong H

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U Ying
Institute of Nephritic and Urinary Disease，People's Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China
[Abstract] Objective To investigate the effects of union treatment of lovastatin and irbesartan on the expression of osteopontin（OPN） and renal tubulointerstitial fibrosis. Methods Experimental SD rats were randomly divided into four groups （n = 10） respectively：sham operation group，unilateral ureteral ligation operation group （UUO group），irbesartan group （60 mg/L） and combination group （with 20 mg/L lovastatin combined 60 mg/L irbesartan）.The rats in sham operation group and UUO group were treated with equal normal saline.After 6 weeks，observing renal function，histopathological changes and 24-hours proteinuria，and detecting the expression of OPN in renal interstitium.Results Irbesartan treatment could reduce the expression of OPN compared with model group （P < 0.05），24 h urinary albumin and serum creatinine （Scr） decreased （P < 0.05） and alleviate the damages of renal histopathology，renal tubular interstitial area was significantly reduced in the model group （P < 0.01）；And lovastatin combined irbesartan treatment，the expression of OPN reduced more significantly，renal function and kidney pathology damage improvement was more obvious.Conclusion By the combined treatment of lovastatin and irbesartan，the expression of OPN is significantly decreased and renal interstitial fibrosis is obviously ameliorated in obstructive nephropathy rats.
[Key words] Lovastatin；Irbesartan；Osteopontin；Tubulointerstitial fibrosis
目前临床上对梗阻性肾病的治疗仅限于解除梗阻，恢复排尿管道的通畅，然而许多患者在梗阻解除后肾功能仍无法恢复，甚至继续恶化。肾小管间质的损伤尤其是纤维化与梗阻性肾病的进展及预后密切相关，是导致终末期肾衰的重要原因，因此，研究梗阻性肾病致肾纤维化的机制将为梗阻性肾病的治疗提供理论依据。
本研究以单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型为研究对象，观察应用Ang Ⅱ受体拮抗剂（ARB）及他汀类药物对肾组织骨桥蛋白（OPN）表达及肾组织形态学的影响，初步探讨两种药物减轻梗阻性肾病小管间质纤维化的可能机制及治疗靶点。1 材料与方法

1.1 动物与分组

40只SD雄性大鼠，许可合格证号SCXK（渝）2007-0005，体质量170～220 g，由重庆实验动物中心提供，按数字随机法分为4组：检测手术对照组（n = 10）、UUO组（n = 10）、厄贝沙坦组（60 mg/L，n = 10）、联合治疗组（洛伐他汀20 mg/L联合厄贝沙坦60 mg/L，n = 10）。术前2 d开始给药，对照组及模型组仅予等量生理盐水灌胃。

1.2 动物处理

单侧输尿管结扎手术后2周麻醉后从颈总动脉采血，离心分离血清，用于测定尿素氮、血清肌酐（Scr）。同时脱髓处死所有大鼠，剖取左侧肾脏，剥离包膜，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，行HE和Masson染色，其他切片用于免疫组织化学。

1.3 大鼠尿蛋白和肾功能的检测

处死大鼠前1 d，将大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，用邻苯三酚红钼络合法测定24 h尿蛋白量。麻醉后处死大鼠时经心脏取血2 ml，用全自动生化分析仪测定Scr。

1.4 肾脏病理改变及肾间质面积

抽取血液后，迅速将残肾取出，肾组织以10%甲醛固定并编号，石蜡包被，2 μm厚连续切片，Masson染色，光镜下观察。200倍光镜下每个标本选取选 10个肾小管间质视野（避开肾小球和大血管），每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。采用显微图象分析系统（Olympus C3040-ADU）对各组染色结果进行积分光密度（IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野（200倍），每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD值，取平均值。

1.5 免疫组织化学法检测OPN的表达

2 μm的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，滴加3%H2O2：去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，加入适当比例稀释的一抗50∶1，37℃孵育1 h。加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，增敏二氨基联苯胺（DAB）显色。镜下观察染况，蒸馏水及时终止反应，自来水冲洗5 min。苏木素淡染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性反应物部位呈棕色，细胞核呈淡蓝色。在400倍的显微镜视野下，每张切片于皮髓质交界处随机取5个不重复视野的肾小球，由摄像系统提取数据化病理图像，输入图像分析系统Motic Images Advanced进行吸光度（A）值计算，取其平均A值进行统计分析。

1.6 统计学处理

采用统计软件SPSS 13.0进行数据分析，实验数据计量资料用均数±标准差（x±s）表示，均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准为0.05。
2 结果

2.1 洛伐他汀联合厄贝沙坦治疗对UUO模型大鼠肾功能及肾间质面积的影响

UUO组24 h尿蛋白量、Scr及肾间质纤维化面积均显著高于检测手术对照组（P < 0.01）。经厄贝沙坦干预治疗后，与UUO组比较，24 h尿蛋白量、Scr及肾间质纤维化面积均显著降低（P < 0.01）。与厄贝沙坦组比较，联合用药组上述指标降低更为显著（P < 0.05）（表1）。
表1 各组大鼠肾功能及肾间质面积的相关指标（x±s）
注：与检测手术组比较，aP < 0.01；与UUO组比较，bP < 0.01；与厄贝沙坦组比较，cP < 0.05

2.2 洛伐他汀联合厄贝沙坦治疗对UUO模型大鼠肾小管及肾小管间质结构变化的影响

检测手术对照组肾小球基底膜、肾小管结构完整（图1A）；模型组肾小球系膜、基底膜毁损，小管结构破坏严重，小管周间质纤维化明显增加（图1B）；应用厄贝沙坦治疗后，肾小球系膜

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、基底膜毁损及小管结构破坏程度减轻，小管周间质纤维化程度得到减轻（图1C），应用洛伐他汀联合厄贝沙坦组上述组织病理损害减轻更为显著（图1D）。
A：检测手术对照组；B：UUO组；C：厄贝沙坦组；D：联合用药组
图1 洛伐他汀联合厄贝沙坦对UUO模型大鼠肾小管间质纤维化的影响（PA×200）

2.3 洛伐他汀联合厄贝沙坦对UUO大鼠肾小管间质OPN因子表达的影响

对照组肾间质几乎无OPN的表达，UUO组肾间质OPN 蛋白的表达较对照组显著增多（P < 0.05），应用厄贝沙坦治疗后，OPN蛋白表达均较模型组明显减少（P < 0.01），在厄贝沙坦基础上加用洛伐他汀治疗OPN蛋白表达则减少更为显著 （P < 0.05）（图2）。
3 讨论
梗阻性肾病肾小管间质的病变程度是决定10年肾脏存活率的最重要的影响因素，其影响程度较肾小球病变的严重程度更为重要。而由OPN所介导的单核巨噬细胞浸润在很大程度上参与小管间质纤维化的过程。肾素血管紧张素系统的激活在肾间质纤维化中发挥重要的促进作用[3]，有报道ARB是可减少血清OPN的表达[4]，但应用ARB制剂及他汀类药物干预后，是否可以通过减少肾脏局部OPN的表达从而减轻梗阻性肾病的肾间质纤维化，经检索，国内外尚未见报道。
厄贝沙坦可竞争性抑制AngⅡ与其受体结合，且主要与 AT 1 受体结合，这类药物除了已经证实的能减少尿蛋白的滤过外，还能抑制细胞增殖、肥大、减少肾小球细胞外基质蓄积[5-6]，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进展[7-9]，但其具体机制尚不明确。OPN是一种富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结合序列的分泌型糖基化磷蛋白，在细胞和基质无机物之间起桥连作用，参与了人体骨吸收、血管生成、肿瘤、动脉粥样硬化、组织纤维化等过程[10]。近年来的研究表明，OPN参与了包括糖尿病肾病、IgA肾病等慢性肾病的发生发展，并与肾间质纤维化关系密切[11-12]。本研究证实OPN亦参与了梗阻性肾病的发生，促进其小管间质纤维化进展，应用厄贝沙坦干预可减少前纤维化因子OPN的表达，并减轻肾小管间质纤维化，改善肾功能损害，但单独应用ARB制剂并不能阻断肾间质纤维化的进展。

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