摘要：中长期空间飞行导致机体发生的骨丢失等航天医学不足,已经成为人类向更深、更远、更高的外层空间探讨的制约因素之一。目前空间飞行采取的运动锻炼、药物预防和营养补充都不能有效防止骨丢失的发生进展;为了确保航天员在未来长期飞行任务中健康、高效工作,需要在细胞分子水平阐明空间骨丢失的发生机制;进展基于细胞分子本质认识的有效对抗防护措施。这是载人航天进展的迫切和必定要求。空间骨丢失是航天员在太空易患疾病的首要风险因素,其发生的主要理由是骨形成减少。失重不但影响成骨细胞的分化进程,还影响其分化起始。启动和调控成骨细胞分化的关键转录因子Cbfa1,也是一个力信号传导的靶分子。骨相关细胞因子参与了成骨细胞的增殖、分化调节,包括对Cbfa1活性的调节。失重影响多个骨相关细胞因子的表达和信号传导。由此,阐明失重条件下骨相关细胞因子在骨丢失中的作用,对骨丢失机制的阐明和进展有效对抗防护措施具有重要作用。前期探讨表明失重条件下,骨相关细胞因子对BMSC和前成骨细胞的增殖、分化的推动作用减弱,使成骨细胞数量减少和活性下降,导致骨形成减弱,进而发生骨质丢失。由此,本探讨构建了能用报告基因反映Cbfa1活性的成骨细胞模型和IGF-I选择性剪接模型;采取细胞回转、大鼠尾吊和液流剪切等力刺激模型;探讨骨相关细胞因子对BMSC增殖、对前成骨细胞Cbfa1活性的影响及可能的机制,观察尾吊大鼠骨骼组织中IGF-I基因表达和调控变化;旨在探讨骨相关细胞因子在失重条件下表达、调控和作用的变化,为阐明空间骨丢失的细胞分子机制提供科学依据。实验策略:(1)采取基于红细胞裂解的全骨髓培养法分离培养BMSC,通过亚蓝染色和流式细胞仪检测,观察回转对BMSC增殖、细胞周期及对细胞因子促增值效应的影响;采取免疫荧光染色、RT-PCR、Western、基因芯片策略,探讨回转对BMSC微丝骨架、ERK1/2活性、成骨向分化、基因表达谱的影响。(2)通过载体构建和稳定转染,构建用报告基因反映成骨细胞Cbfa1活性的模型,通过EGFP的荧光强度半定量浅析或Luc酶活性浅析,探讨不同重力、VD3和BMP2对Cbfa1活性的影响以及回转条件下Cbfa1对VD3和BMP2的响应特点;通过双向CO-IP,观察回转和超重条件下VDR与Cbfa1相互作用的变化;采取微丝骨架破坏剂CB和稳定剂JAS,探讨细胞微丝骨架在BMP2诱导Cbfa1活性中的作用。(3)利用细胞回转和大鼠尾吊模型,采取RT-qPCR策略,探讨回转和不同尾吊时间对成骨细胞、骨骼组织IGF-I选择性剪接异构体表达的影响;通过PCR扩增和基因亚克隆,构建了4个含IGF-I外显子5及两侧不同长度内含子的选择性剪接载体,分别稳定转染到MC3T3-E1中,建立IGF-I选择性剪接模型;利用流体剪切实验系统;观察1Pa剪切力刺激1小时对IGF-I选择性剪接的影响。结果发现:(1)回转破坏细胞微丝骨架,并具有时间依赖性;使G1/G0期的细胞数量增加,由86.6%增加到91.4%,以而抑制了BMSC增殖;降低了信号分子ERK1/2活性和细胞因子IGF-I、EGF和bFGF对BMSC的促增殖作用,促增殖效应分别由15.5%、16.3%和26.9%下降到10.5%、10.3%和19.6%;抑制了BMSC的成骨向分化潜能;基因表达谱和功能聚类浅析表明与细胞周期、微丝骨架、成骨细胞分化相关基因的表达发生了转变,且表达升高的负调控基因占多数。(2)建立了能用EGFP或Luc报告基因反映Cbfa1活性的成骨细胞模型;发现回转抑制Cbfa1活性,而超重能提升Cbfa1活性;VD3和BMP2均可提升Cbfa1的活性,但回转可降低VD3和BMP2对Cbfa1活性的刺激作用,回转条件下VD3和BMP2诱导的Cbfa1活性增加分别由79%和18%下降到43%和14%,同时VD3受体VDR与Cbfa1之间的相互作用受到抑制;回转可破坏MG63的微丝骨架;低浓度微丝骨架破坏剂CB(0.5nmol/L)降低了BMP2对Cbfa1活性的增强作用,而微丝骨架稳定剂JAS在一定程度上能保护BMP2对Cbfa1活性的刺激作用。(3)大鼠尾吊降低骨骼组织IGF-IEa和MGF的表达,且具有时间依赖性;使血清中IGF-I水平下降。筛选出了4个分别稳定转染含外显子5及两侧不同长度内含子的IGF-I选择性剪接载体的细胞株;1Pa流体力能显著提升稳定转染p5341选择性剪接载体细胞株的MGF-EGFP表达,而对其他细胞株没有影响。结论:回转抑制了BMSC的增殖和骨向分化潜能,降低其对细胞因子IGF-I、EGF和bFGF的响应性。回转通过削弱VDR与Cbfa1之间的相互作用,降低了VD3对Cbfa1活性的刺激作用;细胞微丝骨架参与BMP2对Cbfa1活性的刺激作用,而回转诱导的微丝骨架解聚可能是Cbfa1对BMP2的响应性下降的重要理由;大鼠尾吊导致骨骼组织IGF-IEa和MGF表达下降和血清IGF-I水平降低;失重可以影响IGF-I选择性剪接。剪切力可通过IGF-I内含子上的元件调控其选择性剪接。这些探讨为阐明空间骨丢失的细胞分子机制提供重要的科学依据。关键词：失重论文骨丢失论文细胞因子论文Cbfa1论文成骨细胞论文选择性剪接论文
缩略语表7-9
中文摘要9-13
英文摘要13-17
前言17-19
文献回顾19-45
空间骨丢失的发生和危害19-23
力负荷是维持骨骼稳态的决定性因素19-20
力负荷减少导致骨丢失的发生20-22
空间骨丢失的危害22-23
空间骨丢失发生的理由23-35
空间骨丢失的生理学机制23-25
失重对成骨细胞的影响25-28
失重对骨髓间质干细胞的影响28-31
失重对成骨细胞特异性转录因子Cbfa1 的影响31-35
骨相关细胞因子对成骨细胞的影响35-42
骨相关细胞因子对Cbfa1表达及活性的影响35-39
失重对骨相关细胞因子的影响39-42
本课题的目的作用42-45
实验一 回转对细胞因子促BMSC 增殖作用的影响45-69
1 材料45-48
1.1 实验动物45-46
1.2 实验试剂46
1.3 主要仪器46
1.4 试剂配制46-48
2 策略48-54
2.1 基于红细胞裂解的BMSC 分离培养48
2.2 免疫细胞化学染色48-49
2.3 亚蓝比色法49
2.4 细胞周期浅析49
2.5 BMSC 的分化潜能鉴定49-50
2.6 BMSC 的回转和离心超重培养50
2.7 细胞微丝骨架染色50-51
2.8 蛋白表达的Western 检测51-52
2.9 半定量RT-PCR 浅析52-53
2.10 基因芯片检测及基因功能分类浅析53-54
2.11 统计策略54
3 结果54-65
3.1 BMSC 的分离培养鉴定54-58
3.2 回转对BMSC 增殖活性的影响58-60
3.3 回转对BMSC 结构的影响60
3.4 回转对BMSC 成骨向分化的影响60-62
3.5 回转对细胞因子促BMSC 增殖作用的影响62-63
3.6 回转对BMSC 基因表达谱的影响63-65
4 讨论65-68
5 小结68-69
实验二 回转对骨相关细胞因子调节CBFA1 活性的影响及其机制探讨69-88
1 材料70-72
1.1 细胞与载体70
1.2 主要试剂70
1.3 主要仪器70-71
1.4 主要试剂配置71-72
2 策略72-75
2.1 6OSE2 启动子序列获取72
2.2 6OSE2 启动子驱动的报告基因表达载体构建72-73
2.3 药物最小致死浓度确定73
2.4 细胞脂质体转染73-74
2.5 细胞处理74
2.6 细胞荧光强度浅析74
2.7 Luciferase 活性检测74-75
2.8 ALP 染色75
3 结果75-83
3.1 反映Cbfa1 活性的成骨细胞模型构建75-78
3.2 不同重力对Cbfa1 活性的影响78-79
3.3 不同重力对VD3 诱导Cbfa1 活性的影响79-80
3.4 不同重力对VDR 和Cbfa1 相互作用的影响80
3.5 回转对BMP2 诱导Cbfa1 活性的影响80-81
3.6 微丝骨架在BMP2 诱导Cbfa1 活性中的作用81-83
4 讨论83-87
5. 小结87-88
实验三 模拟失重对IGF-I 选择性剪接异构体表达的影响88-106
1 材料89
1.1 细胞与载体89
1.2 主要试剂和仪器89
2 策略89-97
2.1 IGF-Ea 和MGF 基因引物设计89-90
2.2 组织总RNA 提取及浓度测定90
2.3 小鼠肌肉基因组DNA 的提取90
2.4 多聚酶链式反应(PCR)90-91
2.5 酶切及连接反应91-92
2.6 选择性剪接载体的构建92-93
2.7 细胞的剪切力刺激93-95
2.8 实时定量RT-PCR 浅析95-96
2.9 大鼠尾吊模拟失重效应96-97
2.10 血清IGF-I 的Epsa 检测97
3 结果97-103
3.1 IGF-I 选择性剪接异构体的qPCR 检测策略97
3.2 尾吊对大鼠骨骼IGF-I 表达的影响97-99
3.3 尾吊对大鼠血清中IGF-I 水平的影响99
3.4 回转对成骨细胞IGF-I 表达的影响99-100
3.5 剪切力对IGF-I 选择性剪接的调控作用100-103
4 讨论103-105
5. 小结105-106
结论106-107
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