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Abstract6-11
引言11-14
第一章 “分子开关”用于 CYP2C19*2 和*3 位点检测策略的建立14-35
1 实验材料14-18
1.1 标本来源14-15
1.2 实验仪器与设备15
1.3 常用材料与试剂15-16
1.4 主要试剂盒16
1.5 常用酶类16
1.6 Marker16-17
1.7 菌株17
1.8 培养基17
1.9 缓冲液和常用试剂的配制17-18
2 实验策略18-25
2.1 检测位点选择18
2.2 PCR 引物设计与合成18-21
2.3 血液 DNA 的提取21
2.4 DNA 样品的定量与质量鉴定21
2.5 样本 DNA 的扩增21-22
2.6 PCR 产物的回收22
2.7 样本测序22-23
2.8 基于“分子开关”技术检测系统的建立和优化23-24
2.9 基于“分子开关”的 PCR 技术特异性鉴定24
2.10 基于“分子开关”的 PCR 技术对 104 例标本的 SNP 分型24-25
3. 结果与浅析25-32
3.1 104 例样本测序结果25
3.2 PCR 扩增系统中 DNA 模板用量的优化25-26
3.3 PCR 扩增系统中退火温度的优化26
3.4 Pfu 酶在扩增系统中的优化26-27
3.5 检测引物 3′末端单/双硫代磷酸化修饰的差别比较27-28
3.6 最佳反应系统的确立及 CYP2C19*2 和*3 三个基因型的检测28-31
3.7 104 例样本 CYP2C19*2 和*3 位点的检测结果31-32
4 讨论32-35
第二章 重组 Tth-SSB 蛋白在基于 PCR 的 SNP 分型反应中的运用35-50
1 实验材料35-38
1.1 标本来源35
1.2 Tth-SSB 基因组35-36
1.3 Tth-SSB 引物的设计与合成36
1.4 CYP2C19*3(636G>A)位点的单硫代检测引物36
1.5 实验仪器与设备36-37
1.6 常用材料与试剂37
1.7 缓冲液和常用试剂的配制37-38
2 实验策略38-40
2.1 Tth-SSB 基因克隆到 pMD19-T 载体上38
2.2 Tth-SSB 基因克隆到 PET-28a 表达载体上38
2.3 Tth-SSB 蛋白的诱导表达和纯化38-39
2.4 SNP 分型反应中 Tth-SSB 蛋白最佳用量的确定39
2.5 Tth-SSB 对 PCR 特异性的影响39-40
2.6 其他添加剂在提升 SNP 分型特异性的探讨40
2.7 添加 Tth-SSB 后对 104 份标本的基因分型40
3 实验结果40-47
3.1 T 克隆后双酶切的鉴定结果40-41
3.2 PET-28a 表达载体克隆后双酶切的鉴定结果41-42
3.3 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 Tth- SSB 结果42-43
3.4 SNP 分型中添加 Tth-SSB 的最佳用量43
3.5 Tth-SSB 对 SNP 分型特异性的影响43-44
3.6 添加 Tth-SSB 在三种基因型分型中的验证效果44-45
3.7 二碱基亚砜添加到扩增系统中的效果45-46
3.8 甜菜碱添加到扩增系统中的效果46-47
3.9 海藻糖添加到扩增系统中的效果47
3.10 104 份标本在添加 Tth-SSB 扩增系统中的检测结果47
4 讨论47-50
结论50-51