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摘要：脑胶质瘤是颅内最为常见的神经上皮肿瘤，虽然近年来，影像学诊断，显微外科手术，化疗，放疗等方面都有不同程度的进步，但在肿瘤的预后上却没有显著的延长。由此如何提升脑胶质瘤的综合治疗疗效一直是神经外科领域的难题。近几年来，关于肿瘤分子生物学方面的探讨不断增加，因而如何阐述胶质瘤发生、进展的分子机制，寻找特异性诊断和治疗的靶标则成为目前胶质瘤探讨的热点。可变剪接机制是基因转录后一项精密而复杂的调控机制，与人类遗传病有着紧密的联系，更被认为是癌症表达的天然来源。针对肿瘤mRNA的可变剪接探讨在针对肿瘤的及时诊断和治疗均有非常重要的作用。MDM4基因（Murine double minute4，鼠双微基因4）是我科在前期工作中利用基因芯片技术筛选出的与胶质瘤患者预后和化疗敏感性相关的一个基因。该基因是p53上游重要的调控因子，但在肿瘤发生中是致癌基因还是抑癌基因的作用目前仍尚存争议。目前考虑MDM4基因的复杂功能和有着的争议可能与MDM4剪切变异体的有着有关；虽然近几年来，MDM4基因在胶质瘤中的功能探讨不断深入，但是在胶质瘤中的剪接现象探讨却鲜有报道。鉴于该基因在胶质瘤中的重要量以及可变剪接现象在肿瘤发生进展中的重要作用，本实验以此为切入点进行相关探讨。本探讨分两部分：第一，MDM4三个新剪接体的发现，验证及生物信息学的浅析；第二，MDM4剪接体在不同组织标本中的表达及与p53突变的联系，及其临床作用。目的：探讨MDM4基因在脑胶质瘤标本中mRNA剪接形式，明确是否有新型剪接体有着，并针对新发现的剪接体利用生物信息学进行其结构及功能进行初步浅析。策略：根据MDM4的cDNA序列设计相应引物，运用RT-PC策略检测MDM4mRNA在胶质瘤中的表达。通过巢式PCR，二次PCR明确产物的特异性，DNA测序，BLAST确定该剪接体的序列及可变剪接方式。Genebank比对及Pubmed文献搜索，最终确定为新型剪接体；进一步利用ExPASy以及SWISS-MODEL，针对MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三种新型剪接体可能翻译的蛋白进行空间结构及功能初步预测。结果：RT-PCR提示产物有六条带，选取效果最佳的引物（EXON10），经二次PCR，巢式PCR，排除非特异性产物，通过比对Marker其分子量分别为：800-900左右，750-800左右，700左右，650左右，550左右，450-500左右；与预期的5条带，851，783，701，607，163有不相符之处，提示可能有新型剪接体的有着；进一步针对PCR产物进行割胶，纯化，直接测序，并将序列进行Blast，发现前三条带（由高到低）分别符合已报道的MDM4-FL，MDM4-S，MDM4-A；后三条带（由高到低）分别为缺失exon6，9；exon8，9；exon6，8，9，通过Genebank及Pubmed文献搜索，均未见报道，最终确定为MDM4基因新型剪接体，命名为MDM4-1，MDM4-2，MDM4。针对3种新型剪接体（MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3）进行生物信息学浅析，剪接体可能编码的蛋白分别为140aa，172aa，140aa；MDM4-1及MDM4-3均缺失exon6，对p53结合域结构没有影响，但终止子在exon7上提前出现，缺失锌指结构及环指结构等，最终可能编码与MDM4-S相同的蛋白。MDM4-2缺失exon8,9，终止子在exon10上提前出现，缺失片段为富酸性残基结合域，可能影响CK1alpha介导的MDM4磷酸化历程，最终影响MDM4对p53的抑制。最后利用ExPASy以及SWISS-MODEL，针对MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3可能翻译的蛋白进行空间结构预测，为进一步探讨其功能奠定基础。结论：MDM4在脑胶质瘤组织中的mRNA剪切形式有6种，其中3种已有报道，另外3种尚未报道，命名为MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3；可变剪接形式均为外显子缺失，分别缺失exon6，9；exon8，9，exon6，8，9。三种新型剪接体p53结合域均有着，可能翻译的氨基酸大小分别为：140aa，172aa，140aa；其中MDM4-1，MDM4-2可能编码与MDM4-S相同的蛋白，最终利用ExPASy以及SWISS-MODEL，针对MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三种新型剪接体可能翻译的蛋白进行空间结构预测。新型剪接体结构上有着p53结合域，可能对于MDM4基因参与p53通路的精细调控有重要作用。目的：了解本实验第一部分中发现的3种新型剪接体MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3；在不同肿瘤组织中的表达情况，在胶质瘤中不同级别中表达情况，与p53，MDM2等基因之间的联系。检测p53的突变情况，进一步浅析MDM4剪接体，p53突变与临床病理的联系，以及对患者存活预后的作用。策略：通过颅内外肿瘤，颅内良恶性肿瘤，不同级别胶质瘤进行RT-PCR，了解新型剪接体在不同肿瘤组织，胶质瘤不同级别间的表达；进一步用Real-time PCR，对新型剪接体在不同级别胶质瘤中的表达进行定量；利用PCR-SSCP检测不同胶质瘤患者p53突变情况，综合实验结果浅析MDM4剪接体与MDM2，p53之间的联系，同时探讨其表达与胶质瘤临床病理特点及肿瘤预后的联系。结果：RT-PCR提示MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三个新型剪接体在多种肿瘤组织及正常组织中均有表达，并非在肿瘤中特异性表达。在不同级别胶质瘤中均有表达，并非在特定级别中特异表达。但出现的条带强弱不一，其中新型剪接体在低级别肿瘤中（I级，II级）表达显著，在III级，IV级中表达较弱。Real-time PCR提示MDM4-1/MDM4-FL比值在不同病理级别间有着统计学差别（p＜0.05），随着病理级别增加且呈负相关（图2.8）。MDM4-S/MDM4-FL比值在不同病理级别间有着统计学差别（p＜0.05），随着病理级别增加呈正相关。MDM4-MDM2-p53作为p53信号通路上重要的信号分子，三者在mRNA水平上彼此相关。PCR-SSCP检测p53突变情况，提示74例胶质瘤患者中，p53突变率为39.2%（29/74），突变的位点分别位于p53基因的exon5-8上。其中胶质母细胞瘤，间变形星形胶质瘤突变率最高，分别达44.4%，52.6%；正常脑组织，毛细胞型星形细胞瘤，室管膜瘤均未见突变。结合临床资料提示：p53突变率与性别，年龄，病理类型无显著相关；但与病理级别显著相关（p＜0.05），高级别胶质瘤（WHOIII级，IV级）显著高于低级别胶质瘤（WHOI级，II级）分别为52.6%，26.1%。p53突变型与野生型胶质母细胞瘤各5例；行Real-time PCR检测MDM4基因及其剪接体的表达量；经统计学浅析，MDM4-FL，MDM4-1的表达量，均有着显著差别（P＜0.05）。MDM4基因的mRNA表达量在p53野生型的胶质母细胞瘤患者中要显著高于p53突变性型。而MDM4-1的表达量在p53突变的胶质母细胞瘤患者中要显著高于p53野生型。33例胶质母细胞瘤根据MDM4-1的平均表达量分为两组，＞0.08为相对高表达组，＜0.08为相对低表达组。Kaplan-Meier法计算各组累计存活时间，统计结果显示相对高表达组存活时间14.4月（95%CI10.7，18.1），相对低表达组存活时间23.6月（95%CI13.9，23.9）。K-M存活曲线浅析显示，MDM4-1低表达组患者存活时间长于MDM4-1高表达组（p＜0.05）。27例经p53突变检测的胶质母细胞瘤患者，采取Kaplan-Meier法计算各组累计存活时间，统计结果显示p53突变型组存活时间11.4月（95%CI7.9，12.1），p53野生型组存活时间22.0月（95%CI13.9，46.1），K-M存活曲线显示，p53野生型组患者存活时间长于p53突变型组（p＜0.05）。结论：MDM4基因的3个新剪接体在颅内外肿瘤中均有表达，在不同级别胶质瘤中， MDM4-1/MDM4-FL比值随着胶质瘤级别的增加而下降；MDM4-S/MDM4-FL比值随着胶质瘤级别的增加而增加。MDM4-FL，MDM2，p53三者表达有显著相关。标本p53突变率为37.7%（29/77），突变的位点分别位于p53基因的exon5-8上。其中胶质母细胞瘤，间变形星形胶质瘤突变率最高。p53突变率在高级别胶质瘤中显著高于低级别胶质瘤；在胶质母细胞瘤中MDM4-FL的表达量在野生型的标本中显著高于突变型，MDM4-1则相反。临床随访存活浅析，提示MDM4-1的高表达，以及p53的突变均提示胶质母细胞瘤患者的预后不良。关键词：可变剪接论文PCR论文生物信息学论文mRNA表达水平论文p53突变论文存活浅析论文
摘要5-9
Abstract9-13
缩略词表13-14
前言14-17
第一部分 MDM4 三个新剪接体的发现，验证及生物信息学浅析17-40
引言17-18
材料与策略18-24
结果24-34
讨论34-37