分析乙型肝炎双功能siRNA对乙型肝炎病毒（HBV）抑制作用学术

摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染严重影响人类的健康和生命安全,目前对慢性HBV感染者和携带者无特效治疗策略。HBV基因组较小,易发生突变,限制了靶向病毒的抗病物探讨。为了探讨和开发新型抗HBV药物,我们设计了一种新型双功能siRNA (5'-ppp-siRNA,-siRNA)核酸药物,一方面通过刺激宿主细胞方式识别受体诱导宿主抗病毒I型干扰素的表达,同时通过RNAi作用特异性沉默HBV基因表达以而抑制病毒复制。-siRNA结合一个核酶复合物以而形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),由RISC介导切割靶mRNA分子中与-siRNA反义链互补的区域,以而达到沉默特异性基因表达作用；同时,-siRNA可以活化维甲酸诱导基因I(retionic-acid-inducible genel, RIG-I),使RIG-I与位于线粒体外膜的衔接蛋白干扰素启动子刺激因子-1(IFN-βpromoter stimulator-1, IPS-1)/CARDIF(CARD adaptor inducing IFN-β)/MS (mitochondrial antiviral signapng)/VISA (virus-induced signapng adapter)相互作用,下传信号,激活核转录因子-κB (nuclear factor-KB, NF-κB)或干扰素调节因子(interferon regulatory factor-3, IRF3)等,诱导I型IFN和促炎因子的表达和分泌,以而实现抑制HBV的目的。本探讨首先通过体外转录生成-siRNA。通过细胞毒性检测发现,在100nM,200nM时-siRNA对HepG2.2.15细胞无显著毒性,但是在500nM时-siRNA对HepG2.2.15细胞具有一定毒性。探讨发现,将IFN-β荧光素酶报告基因与RIG-I共同转染HepG2.2.15细胞,同时转入海肾虫荧光素酶报告基因作为内参,转染24小时后将-siRNA转染细胞,16小时后检测IFN-p荧光素酶活性,发现未转染RIG-I时-siRNA只能微弱地诱导IFN表达,但是共转RIG-I后-siRNA显著地诱导IFN表达,说明在HepG2.2.15细胞中-siRNA具有RIG-I依赖的激活宿主抗病毒天然免疫反应。然而,我们用CIAP去除-siRNA5’末端的5’-PPP基团后,将其与IFN-p荧光素酶报告基因和RIG-I共同转染HepG2.2.15细胞后,检测IFN-β荧光素酶活性发现经CIAP处理的-siRNA并未激活RIG-I介导的IFN通路,说明-siRNA诱导IFN表达主要是依赖于其5’末端的5'-ppp基团。此外,-siRNA对干扰素刺激调控元件(ISRE)也具有RIG-I依赖的激活效应,在未共转RIG-I时-siRNA微弱地诱导ISRE表达,然而共转RIG-I后-siRNA显著地诱导ISRE表达。抗病毒活性测定发现,在HepG2.2.15细胞中,与siRNA抗HBV活性相比,-siRNA体现出更显著的抗病毒活性。-siRNA转染48小时后对HBsAg、HBeAg以及HBV DNA和HBV mRNA都有显著的抑制效果。-siRNA对HBV具有持续的抑制效应,当转染-siRNA后48小时、96小时、144小时,-siRNA对HBsAg和HBeAg的抑制率分别是55%和41.8%、37%和24.3%、33.3%和14.8%；当共转染RIG-I和-siRNA时,-siRNA对HBsAg和HBeAg的抑制率分别是66.3%和53%、55.5%和49.7%、45.6%和26.5%。与只转染-siRNA相比,共转染RIG-I时-siRNA对HBV体现出更显著的抑制活性。以不同剂量(50nM、100nM、200nM)-siRNA转染HepG2.2.15细胞,发现-siRNA对HBV的抑制作用呈显著剂量依赖性。综上所述,本探讨成功设计了一种新型双功能抗HBV核酸药物-siRNA,一方面具有能通过RNAi特异识别并切割HBV mRNA靶分子以而抑制HBV特性；同时,可以激活宿主细胞RIG-I依赖的抗病毒天然免疫反应,以而高效阻止HBV复制。抗HBV双功能-siRNA核酸药物的发现为探讨开发新型抗HBV药物探讨具有重要运用价值。关键词：乙型肝炎病毒(HBV)论文siRNA论文基因沉默论文RIG-Ⅰ论文

摘要4-6

ABSTRACT6-8

符号说明8-9

第一章 文献综述9-14

1 -SIRNA的生物合成9-10

2 -SIRNA的双功能效应10-11

2.1 -SIRNA沉默特异性的基因表达10

2.2 -SIRNA对RIG-Ⅰ信号通路的激活10-11

3 -SIRNA的运用11-12

3.1 -SIRNA在抗肿瘤免疫治疗中的运用11-12

3.2 -SIRNA在抗病毒免疫治疗中的运用12

4 总结与展望12-14

第二章 实验材料及策略14-25

1 实验材料14-17

1.1 细胞株14

1.2 质粒14

1.3 主要试剂14-15

1.4 主要仪器与设备15-16

1.5 寡核苷酸序列16

1.6 体外转录DNA模板16-17

1.7 体外转录试剂盒17

2 实验策略17-25

2.1 化学合成SIRNA17

2.2 体外转录法制备-SIRNA17-19

2.3 细胞毒性检测19

2.4 双荧光素酶报告基因检测法19-20

2.5 CIAP处理-SIRNA20

2.6 WESTERN BLOT20-21

2.7 ELISA策略检测HBSAG、HBEAG21

2.8 荧光定量PCR检测策略检测HBV DNA21-22

2.9 HBV MRNA表达水平检测22-25

第三章 实验结果与讨论25-45

1 前言25-28

2 实验结果28-41

2.1 -SIRNA的生物合成及其细胞毒性检测28-30

2.1.1 靶向HBV的SIRNA设计28

2.1.2 -SIRNA的制备28-29

2.1.3 -SIRNA对HEPG2.2.15细胞增殖的影响29-30

2.2 -SIRNA对RIG-Ⅰ介导的IFN通路的调节作用30-34

2.2.1 -SIRNA激活RIG-Ⅰ介导的IFN通路30-33

2.2.1.1 蹄选转染载体30-31

2.2.1.2 -SIRNA激活HEK293T细胞内RIG-Ⅰ介导的IFN通路31-32

2.2.1.3 -SIRNA诱导HEPG2.2.15细胞中RIG-Ⅰ介导的IFN表达32

2.2.1.4 -SIRNA激活干扰素刺激应答元件(ISRE)32-33

2.2.2 5'PPP是-SIRNA激活IFN-β信号通路的关键基团33-34

2.3 -SIRNA抗乙型肝炎病毒生物学效应34-41

2.3.1 -SIRNA对HBV DNA和HBSAG、HBEAG表达的抑制作用34-36

2.3.2 -SIRNA对HBV MRNA的抑制作用36-37

2.3.3 5'PPP基团显著提升-SIRNA对HBV的抑制活性37

2.3.4 -SIRNA对HBV的抑制作用具有显著剂量效应37-38

2.3.5 靶向HBV不同阅读框(ORF)的-SIRNA对HBV复制的抑制作用38-39

2.3.6 -SIRNA抑制HBV的作用呈时间依赖性39-41

3 讨论41-45

3.1 HBV感染及药物探讨近况浅析41-43

3.2 RIG-Ⅰ介导的IFN信号通路43-44

3.3 HBV特异性SIRNA44

3.4 -siRNA抑制HBV的生物学效应浅析44-45