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摘要：目的：探讨胰蛋白酶酶解法及丙酮沉淀法提取蜈蚣的最佳工艺条件,并检测分离纯化的多肽类有效部位抗肿瘤活性。策略：1.采取L9(34)正交设计法,取胰酶用量、酶解温度和酶解时间三个因素,各取三个水平,并结合丙酮沉淀法制备蜈蚣多肽类有效部位粗提物。以提取率为指标结合MTT法检测各粗提物对人肝癌HepG2细胞的IC50筛选出最佳提取工艺条件。2.采取Sephadex G-25凝胶过滤层析对最佳工艺所得粗提物进行分离纯化,采取MTT法检测纯化物对HepG2细胞、Bel-7042细胞和A549细胞的增殖抑制作用,高效液相色谱检测最有效部分的成分情况,Hoechst荧光染色法观察HepG2细胞凋亡形态,流式细胞术检测细胞凋亡与周期。结果：1.胰蛋白酶酶解法最佳工艺为：2.0g蜈蚣超微粉,胰酶量为0.1g,酶解温度为46℃,酶解时间为4h。2.经Sephadex G-25凝胶过滤层析分离得到三部分,其中第二部分对肝癌HepG2细胞Bel-7042和A549细胞杀伤作用最大。3.与阴性对照组比较,纯化物A2作用后的HepG2细胞周期体现为GO/G1期细胞比例下降,G2/M期细胞比例均升高,差别有显著统计学作用(P0.01)。结论1.本探讨验证了利用酶解法、凝胶层析分离纯化工艺提取蜈蚣小分子多肽类有效部位的可行性。2.所筛选出的蜈蚣小分子多肽类有效部位纯化物A2具有显著的体外抗肿瘤活性。3.所筛选出的蜈蚣小分子多肽类有效部位纯化物A2可通过诱导细胞凋亡,使细胞停滞于G2/M期,减少有丝分裂,以而抑制肿瘤生长。关键字：蜈蚣；提取工艺；正交设计；分离纯化；抗肿瘤关键词：蜈蚣论文提取工艺论文正交设计论文分离纯化论文抗肿瘤论文
缩略语5-6
中文摘要6-8
ABSTRACT8-11
引言11-13
第一部分 蜈蚣酶解法提取工艺优化13-26
1 材料与策略13-19
1.1 细胞株来源13
1.2 药物及试剂13-14
1.3 主要仪器设备14-15
1.4 实验策略15-19
2 结果19-26
第二部分 蜈蚣小分子多肽类有效部位的分离纯化及抗肿瘤活性筛选26-40
1 材料与策略26-33
1.1细胞株26
1.2 药物及试剂26
1.3 主要仪器设备26-27
1.4 实验策略27-32
1.5 统计学策略32-33
2 结果33-40
2.1 sephadex G-25凝胶层析色谱图33
2.2 分离纯化的小分子多肽类各有效部位的多肽含量测定33-34
2.3 纯化物A1、A2、A3对HepG2细胞、Be1-7042和A549细胞增殖抑制作用的影响34-36
2.4 C18反相高效液相对A2的成分情况考察36-37
2.5 纯化物诱导HepG2细胞凋亡及对细胞周期的影响37-38
2.6 荧光显微镜下HepG2细胞的凋亡形态38-40
第三部分 讨论40-46
1 蜈蚣抗肿瘤探讨40-41
2 蜈蚣提取策略探讨41-42
3 蜈蚣有效成分的分离与纯化42-44
3.1 凝胶过滤层析在动物类药中的运用42-43
3.2 蜈蚣有效成分分离与纯化43-44
4 筛选出的小分子多肽类组分对人肝癌HepG2细胞生物学行为的影响44
5 进一步探讨与展望44-46
结论46-47
致谢47-51
附录1 文献综述51-61