摘要：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在常见的恶性肿瘤中居于第五位，是第三大肿瘤死亡理由。我国每年HCC的发病率约占世界55％，HCC已成为我国第二位恶性肿瘤致死理由。由于HCC发病机制尚不清楚，目前抗肿瘤药物不良反应大，临床上迫切需要寻找高效、低毒的有效物质来抑制HCC细胞侵袭和转移，以而给予更好的干预。在培养的HCC细胞和人HCC组织中COX-2的表达与Akt磷酸化正相关。体内外实验表明，COX-2参与了抑制caspases3和caspases9的活性、降低p53和Bax的表达、增强Akt的活性，可能有抑制肝细胞的调亡的作用。这些现象提示COX-2的表达与肿瘤的发生、进展有着密切联系。而PGE_2作为COX-2的催化产物，在HCC中的水平随着COX-2水平的升高而升高。已知PGE_2通过激活细胞表面的PGE_2受体(prostaglandin E receptor, EP)，与不同的G蛋白偶联，启动下游信号通路而发挥其对细胞功能的调节作用。探讨发现，在HCC中EP_1的表达最为丰富。表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶或一些天然药物中的活性成分，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性。EGCG具有较强的抗氧化活性，能够保护细胞和DNA免受损害，并有抗辐射和紫外线等生物学功能。近年来，大量实验证明EGCG能干扰癌细胞存活所需的信号传递，如EGCG能与Bcl-2、Bcl-xL的疏水域紧密地结合，有效抑制抗凋亡Bcl-2家族成员，推动肿瘤细胞凋亡。EGCG降低某些致癌物质的活力、提升癌细胞对化疗的敏感性等作用。结合以上背景资料，探讨PGE_2/EP_1信号通路在HCC进展中的作用和EGCG对其的影响，寻求HCC治疗新靶点以及为EGCG用于HCC的治疗提供实验依据。目的：观察HCC患者血清中PGE_2水平及EP_1在HCC细胞和人肝细胞中的表达，浅析PGE_2及EP_1激动剂ONO-DI-004对HCC增殖和移行的相关性，探讨EGCG对PGE_2或ONO-DI-004刺激的HCC的抑制作用及对HCC细胞周期、凋亡、PGE_2、EP_1和Bcl-2表达的影响，初步探讨EGCG抗HCC的作用靶点和机制。策略：HepG2细胞设置组别为：对照组、PGE_2(0,4,40,400,4000,40000nM)组、EGCG (12.5,25,50,100μg/mL)组、PGE_2(4,40,400,4000)+EGCG(100μg/mL)组、ONO-DI-004(4,40,400,4000nM)组、ONO-DI-004+EGCG(100μg/mL)组、ONO-8711(210nM,1,5,10μM)组。MTT法检测HepG2的增殖；细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测HepG2的移行；Western blot assay和免疫荧光实验检测HepG2中EP_1、Gq和Bcl-2蛋白的表达；酶联免疫浅析法检测HCC患者血清PGE_2及HepG2产生PGE_2和VEGF的水平；流式细胞技术检测HepG2细胞周期和凋亡。结果：1. HCC患者的血清中PGE_2的水平呈高表达与正常志愿者血清中的PGE_2水平比较，HCC患者的血浆中PGE_2的水平呈高表达。2.降低PGE_2和VEGF水平、下调EP_1和Bcl-2的表达是EGCG抑制HCC的重要作用与对照组相比，EGCG (12.5,25,50,100μg/mL)显著降低HepG2中PGE_2和VEGF水平。EP_1在肝癌细胞株MHCC-97L和HepG2中的表达显著高于在人肝细胞株L02中的表达。EGCG (100μg/ml)能显著抑制EP_1受体以及ONO-DI-004诱导的Bcl-2的表达(**P0.01)。3. EGCG对外源性PGE_2或ONO-DI-004刺激HCC增殖和移行具有显著的抑制作用观察EGCG (12.5,25,50,100μg/mL)作用于HepG2后对细胞的增殖作用，100μg/mL EGCG对HepG2作用24h后可显著抑制HepG2的生长(**P0.01),细胞的平均抑制率为41%。24h的药物浓度与抑制率具有相关性(r=0.8，P=0.02)。EGCG对HepG2具有显著抑制作用。细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察PGE_2(4μM)和ONO-DI-004(400nM)刺激后，HepG2移行较对照组显著增加，EGCG和ONO-8711均能显著抑制HepG2移行，且给予EGCG (100μg/mL)后可显著降低PGE_2和ONO-DI-004刺激的HepG2的移行(**P0.01)。4. EGCG能推动HepG2凋亡流式细胞术检测细胞凋亡率，HepG2经ONO-DI-004(400nM)、PGE_2(4μM)、EGCG (100μg/mL)、EGCG (100μg/mL)+ONO-DI-004(400nM)以及EGCG (100μg/mL)+PGE_2(4μM)作用24h，对照组的细胞凋亡率为(2.36±2.51)%, EGCG (100μg/mL)处理组的凋亡率为(16.8±1.73)%，EGCG (100μg/mL)处理组与对照组的细胞凋亡率相比差别性显著(**P0.01)。ONO-DI-004(400nM)处理组的凋亡率为(0.6±1.86)%, EGCG (100μg/mL)+ONO-DI-004(400nM)处理组的凋亡率为(12.25±2.64)%，两组间的差别具有显著性(**P0.01)。EGCG (100μg/mL)可显著的诱导HepG2细胞的凋亡，对PGE_2、ONO-DI-004刺激的HepG2细胞也有显著的促凋亡作用。结论1. HCC患者血清中PGE_2表达异常升高，提示PGE_2在HCC患者中发挥重要作用；2. HCC细胞株中EP1表达较正常肝细胞异常升高，PGE_2可能通过EP1发挥促HCC作用；3. EGCG呈浓度依赖性抑制由PGE_2和ONO-DI-004刺激引起的HepG2的增殖和转移，抑制HCC异常增殖、移行、细胞周期，诱导凋亡是EGCG的重要作用；4. EGCG抑制HepG2产生VEGF和PGE_2，降低EP1及ONO-DI-004刺激的Bcl-2的表达，但对Gq蛋白的表达没有影响，降低PGE_2和VEGF水平、下调EP1和Bcl-2的表达是EGCG抑制HCC增殖和移行、诱导凋亡的重要机制之一。关键词：肝细胞癌论文环氧化酶-2论文前列腺素E_2论文前列腺素E_2受体论文表没食子儿茶素没食子酸酯论文
英文缩略词对照7-9
摘要9-13
Abstract13-17
前言17-22
1 材料与策略22-34
1.122-25
1.1.1 细胞株22
1.1.2 肝癌患者血清22
1.1.3 药物和试剂22-24
1.1.4 仪器与设备24-25
1.2 策略25-34
1.2.1 细胞培养25
1.2.2 细胞生长抑制实验(MTT 法)25-26
1.2.3 体外 Transwell 移行实验26-27
1.2.4 细胞划痕实验27
1.2.5 PGE2含量的测定27-28
1.2.6 VEGF 水平的检测28
1.2.7 流式细胞术检测细胞周期和凋亡28-29
1.2.8 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 EP_1及 Gq 蛋白表达29-32
1.2.9 免疫荧光实验32-33
1.2.10 统计学处理33-34
2 结果34-54
2.1 HCC 患者血清中 PGE_2含量34
2.2 EP1在肝癌细胞株 MHCC-97L 和 HepG2 以及人肝细胞株 L02 的表达34-35
2.3 PGE2和选择性EP1激动剂ONO-DI-004对HepG2增殖的影响35-38
2.3.1 PGE_2对 HepG2 增殖的影响35-36
2.3.2 选择性 EP_1激动剂 ONO-DI-004 对 HepG2 增殖的影响36-38
2.4 选择性 EP_1拮抗剂 ONO-8711 对 HepG2 增殖的影响38
2.5 EGCG 对 HepG2 增殖的影响38-41
2.5.1 EGCG 对 HepG2 增殖的影响38-40
2.5.2 EGCG 对 PGE_2刺激 HepG2 增殖的影响40
2.5.3 EGCG 对 ONO-DI-004 刺激 HepG2 增殖的影响40-41
2.6 EGCG 对 HepG2 产生 PGE_2和 VEGF 的影响41-43
2.6.1 EGCG 对 HepG2 产生 PGE_2的影响41-42
2.6.2 EGCG 对 HepG2 产生 VEGF 的影响42-43
2.7 EGCG 对 HepG2 移行的影响43-47
2.7.1 细胞划痕实验检测 EGCG 对 PGE_2和ONO-DI-004刺激的HepG2 移行的影响43-45
2.7.2 不同浓度 EGCG 对 PGE_2刺激 HepG2 移行的影响45-46
2.7.3 EGCG 对 ONO-DI-004 刺激 HepG2 移行的影响46-47
2.8 EGCG 对 HepG2 凋亡和细胞周期的影响47-50
2.8.1 EGCG 对 HepG2 凋亡的影响47-49
2.8.2 EGCG 对 HepG2 细胞周期的影响49-50
2.9 EGCG 对 HepG2 EP_1, Gq 和 Bcl-2 蛋白表达的影响50-54
2.9.1 Western blot 法检测 EGCG 对 HepG2 EP_1、Gq 和 Bcl-2 蛋白表达的影响50-51
2.9.2 细胞免疫荧光法检测 ONO-DI-004 对 HepG2 中 EP_1表达的影响51-52
2.9.3 细胞免疫荧光法检测 EGCG 对 HepG2 中 EP_1表达的影响52-54
讨论54-59
1. PGE_2及其受体信号异常显著推动HCC的增殖和转移54-55
2. 抑制 HCC 异常增殖、移行、细胞周期及诱导凋亡是 EGCG 的重 要作用55-56
3. 降低 PGE_2和 VEGF 水平、下调 HCC EP_1的表达，是 EGCG 抑制 HCC 增殖和侵袭转移的重要机制之一56-59
结论59-60
本论文的革新点60-61
今后工作设想61-62
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