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摘要：环氧乙烷高级脂肪醇(OHAA)是一种天然安全、操作简单、成本低廉,而且保鲜效果好的新型保鲜材料。C16、C18等高级脂肪醇是生产OHAA的主要原料,目前高级脂肪醇市场主要被石油来源的合成醇和天然油脂来源的天然醇产品所占据。随着石油和天然油脂资源的短缺和的不断上涨,越来越多的探讨开始转向利用低成本、可再生的糖类来进行高级脂肪醇的生物合成。该探讨主要利用工程大肠杆菌来制备C16、C18高级脂肪醇。游离脂肪酸是脂肪醇生物合成途径中重要的代谢中间物,为了更好的进行高级脂肪醇的生产,首先对工程大肠杆菌合成游离脂肪酸进行了探讨,主要是通过过量表达硫酯酶来解除大肠杆菌的脂酰-酰基载体蛋白(ACP)对脂肪酸以头合成的反馈抑制,并进而加强游离脂肪酸的合成。分别在大肠杆菌中过量表达了BTE, AtFatA, TesB,'TesA, YneP, Tesl和TesB2等7种不同的硫酯酶,并选择过量表达硫酯酶BTE的工程菌株为例,进行了游离脂肪酸生产条件的优化,发现工程菌株在30℃诱导培养条件下,利用0.25mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,能够取得最高的游离脂肪酸产量,另外,发现利用37.8g/LNa2HPO4·12H2O;和7.5g/LKH2PO4作为培养基中磷酸盐的浓度,能够最大限度的提升培养基的PH缓冲能力,取得最高的菌体密度。在优化的培养条件下,对表达不同硫酯酶的工程菌株进行了摇瓶培养和产物浅析,发现过量表达BTE, AtFatA和tesA基因的工程菌株能大幅度提升大肠杆菌的脂肪酸生产能力,分别获得了349.1mg/L,137.2mg/L和288.5mg/L的游离脂肪酸产量,而表达其它硫酯酶的工程菌株没有显著提升游离脂肪酸的产量。同时发现表达硫酯酶BTE的工程菌株主要生产C12和C14链长的游离脂肪酸,表达硫酯酶AtFatA的工程菌株主要生产C16和C18链长的游离脂肪酸,而表达硫酯酶'tesA的工程菌株主要生产C14-C18链长的游离脂肪酸,综合评价它们的脂肪酸总产量和组成,得出硫酯酶'tesA更适合用于大肠杆菌中高级脂肪醇的生物合成途径。在获得了合适底物特异性的硫酯酶,并改善了大肠杆菌的游离脂肪酸生产条件之后,又对游离脂肪酸到脂肪醇转化历程中的脂酰-CoA合成酶和脂酰-CoA还原酶进行了探讨。首先对脂酰-CoA还原酶FAR的底物特异性进行了测定,发现其对C16和C18等长链脂酰-CoA具有高的底物特异性,适合用于高级脂肪醇的生产。接下来比较了三种不同来源的脂酰-CoA合成酶FadD, Yngl和FAA2对脂肪醇生物合成的影响,和脂酰-CoA合成酶Yng1、FAA2相比,脂酰-CoA合成酶FadD展现了最高的催化活性,对应的工程菌株获得了最高的脂肪醇产量。通过一系列的代谢途径优化,最终获得了一个最优的工程菌株Zh054。ZhO54能够高特异性的生产C16、C18高级脂肪醇,其产生的高级脂肪醇占脂肪醇总量的比例高达89.2%。在5L发酵罐水平,Zh054取得了101.5mg/L的高级脂肪醇产量,代表了目前高级脂肪醇生物合成的最高产量。该探讨提供了一条绿色环保,生产历程友好的高级脂肪醇生产方式,并取得了一系列重要的进展和突破,为高级脂肪醇的生产提供了一条新的进展思路,并为最终利用来源丰富、低廉的木质纤维素资源来进行高级脂肪醇的生产,提供了一个重要的探讨基础。关键词：脂肪醇论文游离脂肪酸论文大肠杆菌论文代谢工程论文发酵论文
摘要4-6
Abstract6-11
1 文献综述11-20
1.1 果蔬涂膜保鲜剂的探讨11-12
1.1.1 果蔬涂膜保鲜剂的探讨进展11
1.1.2 新型果蔬保鲜剂——环氧乙烷高级脂肪醇11-12
1.2 高级脂肪醇12-20
1.2.1 高级脂肪醇的性质12-13
1.2.2 高级脂肪醇的运用13-14
1.2.3 高级脂肪醇的生产近况14-20
2 材料与策略20-31
2.1 材料与仪器20-22
2.1.1 材料20-21
2.1.2 仪器21-22
2.3 实验策略22-31
2.3.1 游离脂肪酸的生物合成22-28
2.3.2 高级脂肪醇的生物合成28-30
2.3.3 产物处理与检测30-31
3 结果与浅析31-47
3.1 游离脂肪酸的生物合成31-37
3.1.1 重组工程菌株的鉴定31-33
3.1.2 表达硫酯酶BTE对E. cop脂肪酸生产的影响33-37
3.2 高级脂肪醇的生物合成37-47
3.2.1 脂酰-CoA还原酶基因FAR过量表达对脂肪醇生物合成的影响37-42
3.2.2 脂酷-CoA合成酶对脂肪醇生物合成的影响42-46
3.2.4 Zh054工程菌株的补料分批发酵46-47
4 讨论与结论47-52
4.1 讨论47-50
4.1.1 游离脂肪酸生产条件的优化47-48
4.1.2 不同硫酯酶对游离脂肪酸产量的影响48-49
4.1.3 不同硫酯酶的底物特异性49
4.1.4 脂酰-CoA还原酶FAR对脂肪醇生产的影响及底物特异性测定49-50
4.1.5 脂酰-CoA合成酶对脂肪醇生产的影响50
4.2 结论50-52