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摘要：探讨背景和目的流行性乙型脑炎(epidemic encephaptis B),也称为日本脑炎(Japaneseencephaptis,JE),简称乙脑,是重要的虫媒病毒传染病,其病原体为乙型脑炎病毒(Japanese encephaptis virus,JEV),简称乙脑病毒。本病1871年首先由日本报道,1924年首次分离出乙脑病毒,中国于1940年用血清学和病毒分离的策略确诊了乙脑病例。多数国家每2～15年出现1次乙脑流行。世界卫生组织(WHO)估计,目前每年乙脑发病约5万例,其中约1/3的病例死亡,存活者20%～40%留有神经麻痹和心理转变等严重后遗症,曾一度被称为“东方的瘟疫”,给社会和家庭造成了巨大的负担。一般认为,JEV在库蚊和野生水鸟之间的循环,猪是重要的扩散宿主。乙脑的传播媒介是蚊虫,在世界范围内已报道以30种不同的蚊虫体内分离出乙脑病毒,国内也有20余种,三带喙库蚊是其中对JEV易感性最高的蚊种,JEV通过三带喙库蚊在野生鸟类、人和家畜之间传播。一般来说虫媒病毒都具有宿主泛嗜性,除了鸟类和猪以外,JEV还可以感染绵羊、家燕、猴子、金黄地鼠、小白鼠并可致病。国内学者曾报道以云南、广西、广东、海南、安徽、贵州的蝙蝠检测到JEV血清抗体。但尚没有分离到JEV或检测到JEV核酸的报道。湖南省是我国乙脑发病较多的地区之一,湖南省的蝙蝠能否携带JEV?如果携带该病毒,与人类乙脑有无联系?为此我们进行了本调查。探讨策略1.标本来源与制备2007年至2008年期间4次收集湖南部分地区的蝙蝠共851只。收集的蝙蝠鉴定种类后无菌解剖取脑组织标本,所取得标本放入1.5ml含RNAlater的冻存管中4℃运输送回实验室进一步处理。脑组织标本加Hanks缓冲溶液用高压消毒过的微量研磨器无菌研磨,研磨液离心后取部分上清进行PCR检测和细胞培养,剩余标本放置-80℃保存。2.RT-PCR以JEV的E蛋白基因区和C/prM蛋白基因区为靶序列设计了一对特异RT-PCR引物和两对通用RT-PCR引物。先用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取脑组织研磨液中的核糖核酸(RNA),用SUPERSCRIPTⅢ1ST STRAND(invitrogen公司)逆转录酶系统和随机引物进行逆转录(RT)合成cDNA;以逆转录产物cDNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)检测所采集蝙蝠标本中的JEV有关基因片段。3.SYBR GreenⅠ实时RT-PCR①引用已得到证实和公认的JEV基因特异性引物,采取SYBR GreenⅠ实时RT-PCR策略对蝙蝠脑组织进行JEV特异基因片段检测。②将SYBR GreenⅠ实时RT-PCR判定为JEV阳性或可疑为阳性的脑组织上清液接种Vero细胞逐日观察细胞病变,并盲传3代,继续观察细胞变化情况。③取细胞液或脑组织上清液脑腔接种1～3天龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况,有可疑发病者,取脑组织继续盲传3代,如出现显著发病者再进行SYBR GreenⅠ实时RT-PCR鉴定。4.细胞培养将脑组织研磨液上清用每ml含有100单位青霉素和硫酸链霉素的Hanks缓冲溶液1:10稀释,将已培养好长成单层的Vero细胞弃去原培养基,加入稀释好的接种液置于37℃、5%CO_2恒温细胞培养箱内吸附2 h,然后弃去吸附液,加入含2%小牛血清的RPMI-1640培养基(Vero细胞)继续培养。观察细胞变化,根据细胞是否发生病变(cytopathiceffect.CPF)判断病毒培养阴性或者阳性,若细胞形态有显著变化,如细胞圆缩、颗粒增加、融合成片或碎裂死亡判断为阳性,阳性者做进一步培养分离及分子生物学检测;若没有细胞形态变化做RT-PCR检测是否有病毒增殖,连续盲传三代,若仍未有形态变化且RT-PCR产物未扩增出目的基因片断就判断为阴性。5.乳鼠接种实验将检测到的阳性样本离心取上清液,颅内接种乳鼠,每只接种0.03 ml。每天观察2～3次,连续观察1周。接种后48h内死亡的乳鼠弃去,视为非特异死亡。乳鼠发病症状为:拒乳、抽搐、侧卧、弓背、直至死亡。若观察1周后无症状出现,则连续盲传,若盲传三代,仍未出现发病症状,且经RT-PCR检测未扩增出目的基因片断则判断为阴性。6.测序和基因浅析①对RT-PCR扩增获得的目的基因进行测序;②测序结果利用GeneBank的BLAST软件进行在线同源性浅析;③在GeneBank下载其他JEV序列,利用Clustal W进行多序列比对浅析;④用MEGA4.0软件,采取Neighbor-Joining法,Jukes-Cantor模型做进化树浅析。结果1.标本收集情况以2007年至2008年期间共4次到湖南部分地区收集蝙蝠。共收集了851只,属于2个科8个种。2个科分别为菊头蝠科(Rhinolophidae)和蝙蝠科(Vespertiponidae);8个种分别为:中菊头蝠(Rhinolophus affinis)496只、大耳菊头蝠(Rhinolophus macrotis)7只、中华菊头蝠(Rhinolophus sinicus)20只、大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)12只、皮氏菊头蝠(Rhinolophus pearsoni)2只、小菊头蝠(Rhinolophus blythi)4只、普通长翼蝠(Miniopterus schreibersi)293只、马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)17只。2.RT-PCR检测结果用RT-PCR策略以2007年所采集344份蝙蝠脑组织标本中检测出2份JEV阳性标本,分别来自湖南YY地区和SY地区,YY地区蝙蝠JEV的携带率为0.69%(1/144),SY地区蝙蝠JEV的携带率为0.50%(1/200)。3.SYBR GreenⅠ实时RT-PCR检测结果用SYBR GreenⅠ实时RT-PCR策略以2008年所采集507份蝙蝠脑组织标本中检测到弱阳性10例,其中湖南YY地区4例和SY地区6例,YY地区蝙蝠JEV的携带率为2.67%(4/150),SY地区蝙蝠JEV的携带率为1.68%(6/357)。4.细胞培养结果用细胞培养分离策略对12份阳性标本进行分离培养,以2007年样本的2例阳性样本中观察到Vero细胞显著病变结果,对2008年的10份阳性样本进行分离培养也观察到较显著的病变结果。5.乳鼠致病性乳鼠接种实验对12份阳性标本进行鉴定,其中2007年的2例阳性样本接种乳鼠在第五天出现显著的抽搐、侧卧、弓背症状;2008年的3例阳性样本接种乳鼠仅出现轻微的抽搐、侧卧、弓背症状的症状,另7例阳性样本接种乳鼠未出现显著症状。6.测序结果本次所检测的蝙蝠JEV分别与NAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株成一个分支,都属于乙脑病毒基因型Ⅲ型。结论本探讨表明栖息于湖南地区的蝙蝠携带JEV,但携带率不高:2007年收集的标本中,YY地区蝙蝠JEV的携带率为0.69%,SY地区携带率为0.50%;2008年收集的标本中,YY地区蝙蝠JEV携带率为2.67%,SY地区携带率为1.68%。对以2007年样本中所检测出的2份乙脑病毒阳性样本进行测序以及基因序列浅析,序列与NAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株序列同源性为96%～100%。关键词：流行性乙型脑炎病毒论文蝙蝠论文RT-PCR论文SYBR论文GreenⅠ实时RT-PCR论文细胞培养论文基因序列浅析论文
中文摘要3-8
ABSTRACT8-15
第一章 前言15-19
1.1 流行性乙型脑炎的流行近况15-16
1.2 乙型脑炎病毒16-17
1.3 乙脑的流行环节17
1.4 蝙蝠与病毒传染病的联系17-18
1.5 本探讨目的18-19
第二章 材料与策略19-32
2.1 蝙蝠标本19
2.2 引物19-21
2.3 试剂与仪器21-24
2.4 病毒检测24-32
第三章 结果32-41
3.1 蝙蝠的来源和种类32-34
3.2 RT-PCR结果34
3.3 VERO细胞培养结果34-35
3.4 SYBR GREEN Ⅰ实时RT-PCR结果35-37
3.5 乳鼠脑接种结果37-38
3.6 基因测序及同源性浅析38-41
第四章 讨论41-46
全文小结46-47