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简析大脑皮质钙离子在镉致体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中作用

收藏本文 2024-01-19 点赞:14307 浏览:52360 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:为探讨钙离子(Ca2+)在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用,本探讨用孕18-19d SD大鼠的胎鼠建立了大脑皮质神经细胞的模型,观察不同时期的细胞形态,NSE免疫组化法鉴定细胞纯度。在细胞培养液中添加不同浓度的醋酸镉(0、5、10、20μmol/L)以及10μmol/L细胞内Ca2+螫合剂BAPTA-AM,使其单独或联合作用于细胞12h,观察镉对细胞的形态学损伤;利用MTT法测定镉及BAPTA-AM对细胞存活率的影响;利用流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞内Ca2+浓度、ROS水平、线粒体膜电位(△ψm);荧光定量PCR法测定钙调蛋白(CaM) mRNA表达;分光光度计法测定细胞膜ATPase的活力。结果表明:①神经细胞培养至第六天形态最佳、活力最强,是用于进一步实验的最佳时期;NSE纯度鉴定结果表明,培养至第六天的细胞纯度可达95%以上。②镉暴露引起细胞形态的变化,使胞体变小,网络消失;影响细胞核的形态,产生凋亡小体。上面陈述的变化呈现一定剂量—效应联系。③镉暴露可使细胞存活率降低,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞存活率呈现上升走势。④细胞凋亡率随染毒浓度的增加呈上升走势,BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈下降走势;⑤细胞内Ca2+浓度随染毒浓度的增加显著或极显著升高(P0.05或P0.01),BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈降低走势,10μmol/L组差别极显著(P0.01),20μmol/L组差别显著(P0.05);⑥细胞内ROS水平升高,随染毒浓度的增加呈降低走势,但仍显著高于对照组(P0.05),BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞内ROS水平均显著降低,其中5μmol/L组差别显著(P0.05),10μmol/L组差别极显著(P0.01)。⑦线粒体膜电位随染毒浓度的增加呈降低走势,10μmol/L组体现极显著(P0.01),20μmol/L组差别显著(P0.05),BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较呈现升高走势,其中20μmol/L组差别极显著(P0.01);⑧细胞膜ATPase活性随染毒浓度的增加呈现显著或极显著的下降(P0.05或P0.01),与20μmol/L染毒组相比,BAPTA-AM联合作用组Na+-K+-ATPase活性显著升高(P0.05),Ca2+-Mg2+-ATPase活性极显著升高(P0.01);⑨与对照组相比,20μmol/L组CaM mRNA表达极显著降低(P0.01),其余无显著变化,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较20μmol/L组极显著升高(P0.01),其余无显著变化。结论:①不同浓度镉暴露可降低神经细胞存活率,损伤细胞形态;②不同浓度镉暴露可使细胞凋亡率升高,细胞内Ca2+浓度升高,ROS水平升高,△ψm降低,细胞膜ATPase活性降低,CaM mRNA表达量降低;③加入BAPTA-AM后,可显著缓解镉引起的各项指标的变化,提示细胞内钙超载在大脑皮质神经细胞凋亡历程中发挥重要作用。关键词:镉论文大鼠大脑皮质神经细胞论文钙离子论文BAPTA-AM论文凋亡论文

    中文摘要3-5

    ABSTRACT5-7

    目录7-9

    符号说明9-11

    上篇 文献综述11-21

    第一章 镉及其对中枢神经系统的毒性探讨进展11-14

    1 镉及其毒性11-12

    2 镉对中枢神经系统(CNS)的影响12-14

    2.1 镉致CNS的形态学转变12

    2.2 镉致CNS生化的转变12

    2.3 镉致中枢行为活动的转变12-13

    2.4 镉对CNS影响的作用机制13-14

    第二章 镉诱导细胞凋亡机制的探讨进展14-18

    1 镉与钙离子(Ca~(2+))调节的凋亡通路14-15

    2 镉与线粒体调节的凋亡通路15-16

    3 镉与MAPK调节的凋亡通路16

    4 镉与内质网调节的凋亡通路16-17

    5 镉与死亡受体调节的凋亡通路17-18

    第三章 细胞内钙离子探讨进展18-21

    1 细胞内Ca~(2+)的平衡18

    2 胞内游离Ca_(2+)浓度的调节18-21

    2.1 质膜上的钙转移系统18-19

    2.2 细胞内的钙转移系统19-21

    下篇 探讨内容21-55

    第一章 镉对大鼠大脑皮质神经细胞的形态学损伤21-34

    1 材料21-22

    1.1 实验动物21

    1.2 主要试剂21-22

    1.3 主要仪器22

    2 策略22-27

    2.1 溶液的配制22-24

    2.2 培养板包被处理24-25

    2.3 大脑皮质神经细胞的分离及培养25

    2.4 大脑皮质神经细胞的形态学观察25

    2.5 大脑皮质神经细胞的纯度鉴定—免疫组化法25-26

    2.6 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响—MTT法26

    2.7 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤26-27

    3 结果27-31

    3.1 大脑皮质神经细胞的形态学观察27-28

    3.2 大脑皮质神经细胞纯度的鉴定结果28

    3.3 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响28-29

    3.4 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤29-31

    4 讨论31-34

    4.1 大脑皮质神经细胞的分离培养31-32

    4.2 大脑皮质神经细胞纯度的鉴定32

    4.3 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响32-33

    4.4 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤33

    4.5 镉对大脑皮质神经细胞核形态的影响33-34

    第二章 Ca~(2+)在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用34-55

    1 材料34-35

    2 策略35-40

    2.1 溶液的配制35-36

    2.2 各实验组镉浓度36

    2.3 细胞内Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM浓度的确定36

    2.4 大脑皮质神经细胞培养及染毒36

    2.5 大脑皮质神经细胞凋亡率的测定36-37

    2.6 大脑皮质神经细胞内Ca~(2+)浓度的测定37

    2.7 大脑皮质神经细胞内ROS水平的测定37

    2.8 大脑皮质神经细胞内线粒体膜电位(△ψm)的测定37

    2.9 大脑皮质神经细胞膜ATPase的测定37-38

    2.10 大脑皮质神经细胞内CaM mRNA表达的测定38-40

    2.11 数据浅析40

    3 结果40-51

    3.1 镉与BAPTA-AM对神经细胞存活率的影响40-42

    3.2 镉与BAPTA-AM对神经细胞凋亡率的影响42-43

    3.3 镉与BAPTA-AM对神经细胞内Ca~(2+)浓度的影响43-45

    3.4 镉与BAPTA-AM对神经细胞内ROS水平的影响45-46

    3.5 镉与BAPTA-AM对神经细胞内△ψm的影响46-47

    3.6 镉与BAPTA-AM对神经细胞膜ATPase活力的影响47-48

    3.7 镉与BAPTA-AM对神经细胞内CaM mRNA表达的影响48-51

    4 讨论51-55

    全文结论55-56

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