甜蛋白Monellin在毕赤酵母中表达与响应面法优化发酵培养基

摘要：本研究利用毕赤酵母表达系统构建了高效胞内表达甜蛋白Monelpn工程菌,响应面法对毕赤酵母发酵基础盐培养基了优化,并5L发酵罐培养比较工程菌在优化前后培养基中Monelpn表达产量。1毕赤酵母子偏爱,人工合成了单链甜蛋白Monelpn基因,并在基因的5’端加有碱基ACG后克隆到pUC18载体上。以载体pUC18-Mon为模板,PCR扩增了Monelpn基因,并在上游引物引入BspT104I酶切位点,下游引物引入KpnI酶切位点,BspT104I和KpnI酶切位点将Monelpn基因克隆到载体pPICZaA,重组质粒pPICZA-Mon,质粒经SacI酶切线性化后,电击转入毕赤酵母宿主菌GSll5,工程菌GS115-pPICZA-Mon。PCR验证阳性转化子,甲醇诱导后,发酵产物经TrincneSDS-PAGE检测甜蛋白Monelpn在毕赤酵母中胞内表达成功。2DesignExpert7.0软件,利用响应面法对毕赤酵母发酵盐培养基优化。用P1ackett-Burman方法研究发酵培养基各成分对响应值的影响,结果酵母提取物、硫酸钙和磷酸缓冲液为三个主要因素;利用最陡爬坡法逼近最大响应区域;中心组合设计和响应面分析最优培养基组:6g/L酵母提取物,0.3g/L硫酸钙,4.5g/L硫酸镁,40g/L甘油,12.5g/L硫酸铵,7.7%100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)。在优化培养基条件下培养,工程菌生物量增加0.5倍。3以摇瓶优化的发酵盐培养基为基础,在德国Bamn公司5L发酵罐上补料-分批发酵。甘油耗尽后开始补加甘油,当菌体浓度OD600达到200左右时开始补加甲醇甘油混合物,4-5h后开始补加甲醇诱导,整个维持DO大于20%,发酵72h后,菌体光密度OD600达到521,甜蛋白Monelpn表达量达

1.2g/L。关键词：Monelpn论文基础盐培养基论文毕赤酵母论文响应面法论文

摘要4-6

ABSTRACT6-11

第1章 文献综述11-27

1.1 甜蛋白简介11-18

1.1.1 甜味剂的应用11-12

1.1.2 甜蛋白的种类和基本性质12-14

1.1.3 甜蛋白的研究进展14-18

1.2 毕赤酵母表达系统18-24

1.2.1 表达系统简介18-20

1.2.2 毕赤酵母表达系统的优点20-21

1.2.3 毕赤酵母表达宿主菌21-22

1.2.4 毕赤酵母的表达载体22-23

1.2.5 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素23-24

1.3 响应面法优化基础盐培养基24-25

1.4 本研究的目的和25-27

第2章 毕赤酵母胞内表达甜蛋白 Monelpn 工程菌的构建27-40

2.1 实验27-28

2.1.1 菌株和质粒27

2.1.2 酶和试剂27

2.1.3 主要实验仪器27

2.1.4 主要试剂的配制27-28

2.2 实验方法28-36

2.2.1 目的基因的28-30

2.2.2 质粒载体pPICZαA 的制备30-31

2.2.3 目的基因与质粒pPICZαA 的双酶切及酶切产物切胶回收31-33

2.2.4 酶切产物的连接及转化感受态细胞33

2.2.5 重组表达质粒载体pPICZA-Mon 的鉴定33-34

2.2.6 重组表达质粒导入毕赤酵母及阳性转化子的筛选34-36

2.3 结果与讨论36-39

2.3.1 Monelpn 基因的设计与合成36

2.3.2 质粒表达载体pPICZA-Mon 的构建36-38

2.3.3 重组质粒pPICZA-Mon 的验证38

2.3.4 毕赤酵母阳性重组子的 PCR 鉴定38-39

2.4 小结39-40

第3章 甜蛋白 Monelpn 在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵盐培养基40-58

3.1 实验40-42

3.1.1 菌株40

3.1.2 实验仪器40

3.1.3 常用试剂40-42

3.2 实验方法42-46

3.2.1 菌种的活化42

3.2.2 重组子的诱导表达42-43

3.2.3 Tricine SDS-PAGE 检测表达蛋白43-44

3.2.4 响应面优化发酵盐培养基44-46

3.2.5 重组毕赤酵母工程菌在发酵罐中高密度发酵46

3.3 结果与讨论46-56

3.3.1 Tricine SDS-PAGE 检测蛋白表达46-47

3.3.2 响应面优化培养基47-56

3.3.3 培养基优化前后蛋白表达量比较56

3.4 小结56-58

第4章 与展望58-60

4.1 本研究的主要58

4.2 本研究的创新之处58-59

4.3 展望59-60