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谈谈仔猪健康仔猪和黄白痢仔猪肠道菌群结构查抄袭率

收藏本文 2024-01-18 点赞:35202 浏览:159136 作者:网友投稿原创标记本站原创

  • 摘要:应用ERIC-PCR技术对健康仔猪与黄白痢仔猪的粪样样品进行了扩增,并对其菌群结构特征进行了系统分析。结果发现,健康仔猪粪样ERIC-PCR图谱相似性较黄白痢仔猪高,仔猪肠道菌群中至少有一种类型的细菌异常增殖,影响正常细菌的正常生存,导致了菌群结构失调,造成黄白痢。基于ERIC-PCR的分子生物学技术来反映仔猪肠道微生物群落结构特征和监测生物种群动态是有效可行的。通过ERIC-PCR的动态监测,发现患黄白痢仔猪粪样菌群多样性减少,结构趋于简单化;健康仔猪个体之间条带的数量、位置及灰度基本一致,其有一些优势条带。
    关键词:ERIC-PCR;菌群结构;系统分析
    1007-273X(2013)02-0021-02
    动物消化道微生物对其宿主在生命活动中扮演着十分重要的角色,这些微生物在消化道内形成一个相对稳定的、开放的微生态系统,并在宿主的整个生命过程中起着重要作用。当某种原因破坏了这一稳定的生态平衡,即出现生态失调反应,影响动物健康。仔猪黄白痢与肠道菌群失调存在一个互为因果的关系,所以,研究腹泻症状动物的肠道菌群结构不仅可以弄清楚消化等生理机制的基础,更有助于诊断和治疗各种由微生物引起的肠道疾病[2-5]。纯培养方法的局限在于肠道内绝大多数未知菌,目前无法用现有的技术培养,而分子生态学的发展为解决这个难题带来了希望[6]。
    ERIC-PCR可以用于分析人工培养的混合菌甚至是天然复杂

    摘自:写论文www.udooo.com

    微生物群落的组成特征[7]。本试验利用ERIC-PCR技术研究健康仔猪与黄白痢仔猪粪样的菌群差异,旨在了解肠道菌群与仔猪黄白痢的发生之间存在的因果规律。本研究分别提取健康仔猪与黄白痢仔猪粪便样品中细菌基因组DNA,经ERIC-PCR后,对产物进行电泳检测和图谱分析,分别得出健康仔猪与黄白痢仔猪肠道菌群结构特征。
    1 材料

    1.1 粪便样品

    健康仔猪粪便样品1 000份,黄白痢仔猪粪便样品5 000 份,于2010年1~4月采自牟平富海种猪场 1~10日龄的仔猪。分别置于-20 ℃保存。

    1.2 主要试剂与仪器

    DNA Marker DL2000(生产批号:038)购自西安沃尔森生物技术科技有限公司;2×PCR Taq酶(生产批号:P-2011)购自广州东盛生物技术科技有限公司。
    低温离心机;PTC-100TM PCR扩增仪;DYY-Ⅲ稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);紫外凝胶成像分析系统(UVP公司,英国);SK-1漩涡快速混匀器。

    1.3 引物设计

    ERIC-PCR引物设计参照Versalovic(1991),见表1(由大连宝生物公司合成)。
    2 方法

    2.1 细菌基因组DNA的抽提

    酚-氯仿抽提法提取细菌基因组做为ERIC-PCR的模板。具体步骤如下:称取1 g左右粪便样品,放入10 mL离心管中;向离心管中加入6 mL TE缓冲液,漩涡震荡2 min,600 r/min离心5 min;将上清液小心转入另一10 mL 离心管中,加入TE缓冲液到总体积为5 mL,并配平,漩涡振荡2 min,1 000 r/min离心5 min;将上清液小心转入另一10 mL 离心管中,加入TE缓冲液到总体积5 mL,并配平,1 200 r/min离心5 min;取上清液,6 000 r/min 离心10 min;弃上清液,将沉淀加入1 mL TE缓冲液溶解并转移到1.5 mL离心管中,6 000 r/min离心10 min;弃上清液,加入1 mL 预冷的丙酮,充分漩涡清洗细菌,6 000 r/min离心5 min;将上述步骤重复2~3次,直到整个菌液中杂色减到最低为止;弃去上清液取下部细菌沉淀,加入100 μL TE和50 μL溶菌酶,37 ℃水浴30 min;加入200 μL裂解液和10 μL蛋白酶K,55 ℃水浴1~3 h;加等体积酚,上下颠倒混匀,静置2 min,12 000 r/min离心10 min,取上清液于另一管中;加等体积V(酚):V(氯仿):V(异戊醇)=25:24:1的溶液,上下颠倒混匀,静置2 min,12 000 r/min离心6 min 取上清液于另一管中;加等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1的溶液,上下颠倒混匀静置2 min,12 000 r/min离心6 min,取上清液于另一管中;加入等体积异丙醇-20 ℃静置30 min,14 000 r/min离心6 min,去上清液,待异丙醇挥发后加入20 μL TE 溶解,-20 ℃保存备用。

    2.2 ERIC-PCR

    反应体系:25 μL的PCR反应液中,2×Taq master mix 12.5 μL,20 pmol/L上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O补充至25 μL。
    反应条件:95 ℃ 7 min,30 个循环(94 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,65 ℃ 8 min),65 ℃ 15 min,4 ℃保存。

    2.3 PCR产物电泳检测

    取PCR扩增产物10 μL,加样于15 g/L琼脂糖凝胶,以10 V/cm的电场强度于1×TAE缓冲液中电泳35 min,于紫外凝胶成像系统观察并照相。

    2.4 图谱分析

    凝胶显色定影后,用GS-800灰度扫描仪(Bio-Rad)扫描,采用分子分析软件包(MolecularAnalys,Bio-Rad)对DGGE凝胶进行分析。
    3 结果

    3.1 粪样菌群结构特征分析

    本试验对黄白痢仔猪粪样和健康对照仔猪的粪样进行了ERIC-PCR扩增(见图1)。每个时间点采集的仔猪粪样ERIC-PCR均重复3次以上,所得图谱均显示较好的重复性。图谱上较亮的扩增条带反映了粪样中的优势菌群,条带数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。由图1可知,健康仔猪粪样的扩增条带数量均比黄白痢仔猪多,扩增图谱位置等都不同。

    3.2 健康仔猪粪样微生物区系分析

    由图1可见,健康仔猪个体之间条带的数量、位置及灰度基本一致,在490 bp处有共有条带。健康仔猪粪样ERIC-PCR图谱相似性较黄白痢仔猪高,提示健康仔猪个体之间具有较高的相似菌群。

    3.3 黄白痢仔猪粪样微生物区系分析

    从图1可以看到,A1-4和B1-4 是黄白痢仔猪粪便样品的肠道菌群结构指纹图谱。从中不难发现,黄白痢仔猪粪便样品和健康仔猪粪便样品的图谱特点有明显的不同,主要表现在黄白痢仔猪粪便样品的肠道菌群结构图谱条带较少,也比较混乱,而且大多数黄白痢仔猪粪便样品菌群结构图谱在1 100 bp和300 bp处有两条共有条带,以上说明了这些仔猪肠道菌群中至少有一种类型的细菌异常增殖,影响正常细菌的正常生存,导致了菌群结构失调,造成黄白痢[8,9]。
    4 结论
    基于ERIC-PCR的分子生物学技术来反映仔猪肠道微生物群落结构特征和监测生物种群动态是有效可行的。通过ERIC-PCR的动态监测,发现患黄白痢仔猪粪样菌群多样性减少,结构趋于简单化;健康仔猪个体之间条带的数量、位置及灰度基本一致,其有一些优势条带。
    参考文献:
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    3.445-48

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    源于:毕业生论文www.udooo.com

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