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摘要：目的探讨微小RNA-16(microRNA-16, miR-16)调控人上皮性卵巢癌细胞skov-3增殖、侵袭及凋亡的作用及机制,以及在人卵巢癌顺铂耐药细胞skov-3/DDP中的表达及其与铂类药物敏感性的联系。策略脂质体ppofectamine2000介导miR-16成熟体模拟物(mimics)及相应的阴性对照片段(negative control RNA, NC)分别转染人卵巢癌细胞株及顺铂耐药细胞株。实时荧光定量PCR检测细胞中miR-16的表达；蛋白印迹法检测细胞中血管内皮生长因子(vascular endothepal growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、凋亡抑制基因(B-cell lymphoma2,Bcl-2)蛋白、原癌基因c-myc蛋白的表达；多种策略测定细胞的增殖侵袭能力；四偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的顺铂半数抑制浓度；caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3酶的活性；流式细胞术检测血清饥饿及低氧条件下细胞的凋亡情况。结果(1)转染1niR-16mimics后skov-3细胞中miR-16水平显著高于转染NC后的细胞(P0.01)；(2)转染niR-16mimics后skov-3细胞中VEGF、MMP-2及Bcl-2蛋白的相对表达量均显著低于转染NC后skov-3细胞(P0.01)；(3)miR-16显著抑制skov-3细胞的增殖及侵袭能力(P0.05)；(4)血清饥饿及低氧条件培养24h后,转染miR-16mimics后skov-3细胞的凋亡率均显著升高,差别有统计学作用(P0.05)；培养48h后,转染miR-16mimics后skov-3细胞的总凋亡率显著高于对照组,差别有统计学作用(P=0.001)。(5)skov-3/DDP细胞中miR-16表达水平显著低于skov-3细胞,约为后者的1/10(P=0.000),转染miR-16mimics后skov-3/DDP细胞中miR-16水平升高约660倍(P=0.001)；(6)skov-3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量较skov-3细胞显著升高,转染miR-16mimics后skov-3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量显著降低(P0.01)；(7)skov-3/DDP细胞转染miR-16mimics后,顺铂半数抑制浓度(14.19±0.06)较转染NC细胞(22.52+0.60)显著降低(P=0.002),且顺铂作用后caspase-3的酶活力单位也显著升高(P=0.000)；(8)顺铂(20ug/ml)作用24h或48h后,skov-3组凋亡率显著高于skov-3/DDP组,转染miR-16mimics的skov-3/DDP细胞凋亡率约为转染NC细胞的1.5倍(P0.01)。结论(1)miR-16能够下调上皮性卵巢癌细胞VEGF、MMP-2及Bcl-2蛋白的表达,抑制细胞增殖侵袭能力,增强其对凋亡刺激的敏感性；(2)miR-16能够靶向下调上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞Bcl-2蛋白的表达,并协同调节c-myc蛋白的表达,增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性,发挥逆转耐药的作用。关键词：微RNAs论文卵巢上皮性癌论文原癌基因蛋白质类论文细胞凋亡论文抗药性论文肿瘤论文
摘要2-4
Abstract4-7
引言7-8
第一章 实验材料与策略8-18
1.1 实验材料8-11
1.1.1 实验细胞系8
1.1.2 实验药物8
1.1.3 主要试剂8-9
1.1.4 试剂配置9-10
1.1.5 主要仪器设备10-11
1.2 实验策略11-18
1.2.1 skov-3细胞及skov-3/DDP细胞的培养11-12
1.2.2 细胞转染12-13
1.2.3 实时荧光定量RT-PCR检测细胞中miR-16的含量13-14
1.2.4 Western-blot检测细胞蛋白的表达14-16
1.2.5 MTT法检测细胞的增殖抑制率及顺铂半数抑制浓度16
1.2.6 EDU标记法测定细胞的增殖能力16-17
1.2.7 Transwell侵袭实验测定细胞的侵袭能力17
1.2.8 caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3酶的活力单位17
1.2.9 流式细胞仪检测细胞的凋亡情况17-18
1.2.10 统计学浅析18
第二章 结果18-24
2.1 miRNA-16对人卵巢癌细胞增殖、侵袭能力及凋亡的影响18-21
2.2 miRNA-16对人卵巢癌细胞顺铂药物敏感性的影响21-24
第三章 讨论24-29
结论29-30