摘要：猪链球菌（Streptocccus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病原。根据其荚膜多糖抗原特性差别可将其分为35种血清型（1-34型，1/2型），其同一血清型不同菌株之间以及不同血清型之间的毒力均有差别，不是所有的血清型均有致病性，也不是同一血清型的分离株都能引起相同的疾病。在养猪产业，S. suis感染是世界范围的不足，它能引起猪脑膜炎，关节炎，肺炎，心内膜炎，流产以及仔猪的突然死亡。该病给养猪业造成的危害较大，是危害西方发达国家养猪业的三大细菌传染病之一，也是多年来一直困扰中国养猪业进展的主要传染病之一。同时，S.suis还是一个被忽略的新发人类病原体，能导致人类脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症及突然死亡的共患病原体。在越南S. suis是导致成人脑膜炎的主要理由，其次是在泰国和香港。2005年，中国有一次重要的爆发，有200多人感染，死亡率达20%；病人体现为中毒性休克综合症，症状为高烧、全身乏力、恶心、呕吐；在严重病例里还出现皮下出血及昏迷等症状。由于1998年和2005年的人感染S. suis的爆发，多数探讨学者把探讨重点都集中在南方的分离菌株上，对北方分离菌株探讨的很少。为了明确S. suis在中国东北地区流行菌株的分布、流行的血清型、毒力的进化及毒力进化的机制，我们在东北地区的黑龙江省、吉林省和辽宁省3个省的23个市县的养猪场无菌条件下采集了鼻拭子2204头份和血液1666份对，对各猪场S.suis的感染情况进行调查；同时对黑龙江省、吉林省、辽宁省部分地区送检的疑似S. suis感染病料组织，通过PCR策略及血清学策略进行了S. suis病原的检测及分离鉴定，结果以23个健康猪场的样品中均检测到链球菌，并分离出155株猪链球菌，其中猪链球菌1型菌株分离到7株，猪链球菌2型菌株分离到39株，猪链球菌7型菌株分离到4株，猪链球菌9型菌株分离到11株，其他型猪链球菌菌株分离到94株；在发病猪感染病料组织里共分离到12株猪链球菌，其中猪链球菌2型10株，猪链球菌7型1株，猪链球菌9型1株。多数分离株在血平板培养基上形成灰色、半透明、边缘整齐的带有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌落，革兰氏染色后镜检可观察到散在排列的革兰氏阳性短链球菌。对S. suis进行分离鉴定的同时，对以黑龙江省鹤岗、讷河、佳木斯、克东、大庆、牡丹江等地区正常猪群采集的血清样品571份，以吉林省5个地区的5个猪场正常猪群采集的血清样品443份，以辽宁省抚顺、盘锦、营口、旅顺、本溪、辽河、开原等正常猪群采集血清样品652份，用本实验室自己表达的GDH蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA策略对采集的血清样品进行猪链球菌抗体的检测，结果黑龙江省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为27.5%、35%、41%、25%、20%、70%，抗体阳性率低与各地S. suis的分离率低相符合；吉林省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为37%、69%、67%、71%、60%，各猪场的抗体阳性率高与各猪场的S.suis分离率高相符合；辽宁省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为97%、97%、55%、68%、81%、79%，各猪场都注射了疫苗，免疫效果较好而起到相应的保护作用，与各猪场S. suis的分离率低相符合；所建立的策略灵敏度高，特异性好，适合于临床血清样品抗体的检测。随后，我们测定了12株来源于病料的分离株的7个管家基因，测序结果通过GenBank数据库进行BLAST浅析，并将7个管家基因位点的序列片段上传至多位点序列分型数据库进行比对，确定菌株的序列型(Sequence type,ST)，结果在猪链球菌2型分离株的MLST比对中发现，来源于不同区域的4株猪链球菌2型分离株与四川省和江苏省人感染病例分离株98012和05zy一样属于ST7型，而另外6株猪链球菌2型分离菌株与猪链球菌2型高致病性的世界大流行P1/7同属于ST1型；ST1型和ST7型都是ST1克隆复合体的成员，两者联系紧密，7个位点中只有1个位点有着差别。同时我们发现另外2株分离株（1株猪链球菌7型，1株猪链球菌9型）的ST型是猪链球菌MLST数据库中没有的即新的ST型，其等位基因图谱分别为8，30，5，34，9，3，25和45，56，1，15，57，52，55，这些新的数据都已上传猪链球菌MLST数据库，结果将丰富猪链球菌MLST数据库，为各国探讨者所利用；对这些分离株进行遗传进化浅析，了解这些流行菌株的变异情况，探讨其变异规律。为探讨不同毒力猪链球菌7型菌株进化的分子基础，本探讨在猪链球菌7型流行病学调查的基础上，对分离到的不同致病力的猪链球菌7型菌株进行了比较蛋白组学的探讨，通过质谱鉴定的手段共识别出我国猪链球菌血清7型不同毒力流行菌株的胞外差别蛋白质点23个，将差别蛋白挖点后进行质谱鉴定，结果得到成功鉴定的有18个蛋白质点，由于在胶上有多个点对应一个蛋白现象的有着，这18个蛋白质点代表13个独立的蛋白质，这些蛋白质多是参与糖酵解、糖代谢、蛋白质合成和基因表达调控的关键酶。在13个蛋白质里我们选取了10个蛋白质的基因通过RT-qPCR策略进行了mRNA水平上的验证，结果这10个差别蛋白基因在mRNA水平上都有表达，其中有9个基因的表达量差别显著（p0.05），RT-qPCR的结果与双相电泳的结果一致。浅析比较蛋白质组学结果及后面的RT-qPCR验证结果，并与不同菌株的致病力相结合，我们将6-磷酸果糖激酶，30S核糖体蛋白，分支酸合酶，胞外溶解蛋白家族5，丙酮酸激酶，核糖磷酸焦磷酸激酶，核糖体再循环因子，翻译延长因子，磷酸丙糖异构酶等9个蛋白定义为不同致病力猪链球菌7型菌株之间的差别表达蛋白，它们的生物学功能分别是6-磷酸果糖激酶具有加速糖酵解的作用；30S核糖体蛋白主要是释放tRNA的部位；分支酸合酶是莽草酸代谢途径里的第7个酶，能催化5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸分支酸转化成分支酸；胞外溶解蛋白家族5具有类似分子伴侣的活性，能携带毒素等小分子物质进出细胞；丙酮酸激酶能使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为ATP和丙酮酸，是糖酵解历程中的主要限速酶之一；核糖磷酸焦磷酸激酶是多种生物合成历程中的关键酶；核糖体再循环因子能参与肽链合成终止之后的核糖体复合物的解体；翻译延长因子主要是翻译作用，但有学者发现肿瘤细胞中比正常细胞中表达量高30倍；磷酸丙糖异构酶能催化磷酸二羟丙酮转化成3-磷酸甘油醛，使之进入糖酵解途径。这些差别蛋白是否影响了菌株的毒力，我们通过基因敲除的策略对差别蛋白功能验证（这部分内容的具体数据由本实验室其它探讨生进行具体论述）。关键词：猪链球菌7型论文分离鉴定论文流行病学调查论文比较蛋白质组学论文差别表达蛋白论文
摘要8-10
Abstract10-12
1 引言12-21
1.1 本探讨课题的国内外探讨进展12-20
1.1.1 猪链球菌的探讨背景12-13
1.1.2 猪链球菌毒力因子国内外探讨近况13-14
1.1.3 猪链球菌的变异与进化14-16
1.1.4 蛋白质组学及其在猪链球菌中的运用16-19
1.1.5 猪链球菌基因敲除技术19-20
1.2 本探讨课题的目的和作用20-21
2 材料和策略21-31
2.1 实验材料21-23
2.1.1 菌株和血清21
2.1.2 主要试剂21
2.1.3 实验动物21
2.1.4 仪器21-22
2.1.5 样品采集22-23
2.1.6 MLST 引物23
2.2 实验策略23-31
2.2.1 猪链球菌的流行病学调查23-25
2.2.2 临床分离株的 MLST 分型25
2.2.3 猪链球菌重组 GDH 蛋白的原核表达25-27
2.2.4 检测猪链球菌抗体间接 ELISA 策略的建立27-28
2.2.5 不同毒力 7 型 S. suis 胞外蛋白比较蛋白组学探讨28-30
2.2.6 统计浅析30-31
3 结果31-50
3.1 猪链球菌的流行病学调查31-37
3.1.1 猪源链球菌的分离统计结果31-32
3.1.2 分离培养与形态学观察32
3.1.3 生化鉴定结果32-33
3.1.4 猪链球菌种及分型 PCR 鉴定33-34
3.1.5 猪链球菌的兰氏分群结果34
3.1.6 东北三省猪链球菌分离数统计结果34-37
3.1.7 统计浅析结果37
3.2 MLST 浅析结果37-38
3.3 GDH 蛋白的原核表达38-41
3.3.1 GDH 基因的 PCR 扩增与克隆38-39
3.3.2 GDH 蛋白的原核表达和 SDS-PAGE 鉴定39-40
3.3.3 表达蛋白的 Westen-blot 鉴定40-41
3.4 间接 ELISA 策略的建立结果41-43
3.4.1 间接 ELISA 相关条件确定试验结果41
3.4.2 交叉反应试验41
3.4.3 批内重复性试验41
3.4.4 批间重复性试验41-42
3.4.5 敏感性试验42
3.4.6 猪链球菌抗体检测结果42-43
3.5 比较蛋白组学的探讨43-50
3.5.1 两株猪链球菌 7 型分离株的致病力实验43
3.5.2 双向电泳结果43-44
3.5.3 质谱鉴定结果44-46
3.5.4 实时荧光定量 RT－PCR 测定及数据浅析46-47
3.5.5 10 蛋白基因的 mRNA 表达量的比较结果47-50
4 讨论50-59
4.1 猪链球菌在东北三省猪场的感染情况50-51
4.2 猪链球菌 7 型分离株的致病性试验51-52
4.3 猪链球菌抗体检测策略的建立52-53
4.4 本探讨发现的差别蛋白的功能浅析53-59
5 结论59-60
致谢60-61
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