摘要：糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等疾病会引起眼底部位的血管增生,使视功能受到严重损害,甚至失明。目前,临床上大都采取眼内注射或激光光凝法治疗眼底血管增生,而这些方式往往会造成视网膜严重不可逆损伤。由此,寻找能够防治眼内血管生成且副作用小的药物具有重大的社会和经济作用。内皮抑素(endostatin, Es)是一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂,我国已将重组人血管内皮抑素研制成具有自主知识产权的国家一类新药(Endostar,即恩度、YH16)用以治疗非小细胞肺癌。与传统化疗药物相比,Es具有毒副作用小、不易产生耐药性等优点。Es不仅在治疗肿瘤方面有其独特的优势,在防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。探讨证明,通过球结膜射、玻璃体腔注射,Es及Es基因均可抑制眼部新生血管的形成。但是,由于Es是生物大分子,不能透过眼球屏障,必须通过眼内注射方式才能发挥疗效,而这种操作方式难度大,容易损伤眼球内组织,甚至会对病人造成不可逆的损伤,所以寻找简便、安全、有效的给药途径具有重要的临床作用。能够穿透细胞膜的HIV-1反式转录因子的蛋白转导域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)能够携带穿透能力差的药物进入细胞,且具有携带药物透穿透眼球屏障的可能性。故本课题拟利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和内皮抑素的抑制新生血管生成的作用,将二者通过基因工程的手段融合在一起,以期获得能够穿透眼球屏障的内皮抑素,达到通过简单的局部滴眼给药预防视网膜或脉络膜血管增生的目标。本课题的探讨内容及取得的主要成果有以下几个方面。1Tat PTD-endostatin (Tat PTD-Es)在毕赤酵母中的表达及纯化本课题构建了Tat PTD-Es融合基因及酵母分泌型表达载体pGAPZαA/Tat PTD-Es(pG/TE)及pGAPZaA/Es(pG/E)。采取电转化法将重组质粒转入毕赤酵母菌(GS115),筛选阳性菌落,SDS-PAGE检测目的蛋白。利用镍离子亲和层析对表达产物进行初步纯化。结果表明Tat PTD-Es的毕赤酵母表达系统构建成功,但表达量低。2Tat PTD-Es在大肠杆菌中的表达、复性及纯化采取大肠杆菌表达系统对Tat PTD-Es及Es进行了融合表达。选用pET28a作为表达载体,构建重组质粒pET28a/Tat PTD-Es (pET28a/TE)和pET28a/Es (pET28a/E),转入E.cop Rosetta(DE3)中诱导表达目的蛋白。选用温度37℃,诱导时间4h的条件对工程菌株进行诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白。摸索了包涵体的洗涤条件,采取直接稀释法对包涵体蛋白Tat PTD-Es及Es进行复性,采取Hi strap预装柱对复性后的蛋白进行了纯化,得到了高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE结果显示Tat PTD-Es的分子量为22kD, Western blot结果显示目的蛋白可以与6xHis抗体结合,表明目的蛋白含有6xHis标签。3Tat PTD-Es的体内外活性及入胞机制探讨采取CCK-8法测定了Tat PTD-Es及Es对人脐静脉内皮细胞EAHY926增殖的抑制作用,结果表明：Tat PTD-Es及Es均能显著地抑制内皮细胞的增殖,且抑制率呈现显著的剂量依赖性,即随着浓度的增加对细胞生长的抑制率也增加;Tat PTD-Es在低浓度时(0.2μmol/L,0.8μmol/L)活性要高于Es,当浓度大于4μmol/L时,Tat PTD-Es及Es抑制率均大于80%。建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,评价复性纯化后的Tat PTD-Es及Es对CAM血管生成的影响,以生理盐水作为空白对照,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为阴性对照,观察了Tat PTD-Es及Es对bFGF诱导的CAM血管生成的抑制作用。与bFGF组(12.18±4.72)比较,Tat PTD-Es及Es组的CAM血管数分别减少至(30.74±6.47)及(14.56±6.21)(p0.05),结果表明,Tat PTD-Es及Es均能够显著抑制bFGF诱导的CAM血管的生成。采取荧光显微镜和流式细胞术对Tat PTD-Es与Es的入胞能力进行了比较。结果表明FITC标记的Tat PTD-Es与Es与人脐静脉内皮细胞EAHY926共孵育4h后,Es组的荧光信号很弱,细胞阳性率仅为33.61%；而Tat PTD-Es组的荧光信号与Es相比有很显著的增强,细胞阳性率高达99.28%,提示Tat PTD与Es融合表达后有利于蛋白质穿透细胞膜进入细胞,而使进入细胞的蛋白质大大增加,可能有利于其在胞内更好地发挥作用。考察了蛋白Tat PTD-Es浓度、孵育时间对人脐静脉内皮细胞EAHY926摄取蛋白质的影响及各种胞吞途径抑制剂对Tat PTD-Es进入人脐静脉内皮细胞EAHY926的影响。结果表明,蛋白质浓度在1μmol/L～10μmol/L范围内,EAHY926细胞对Tat PTD-Es的摄取有剂量依赖性,相对荧光强度以20.72AU增加到305.23AU。随着Tat PTD-Es与细胞孵育时间的延长,EAHY926对Tat PTD-Es的摄取也逐渐增加。5min-2h内荧光强度增加较为迅速,荧光强度以17.16增加到221.37,之后增加较为平缓,4h时的荧光强度增加至249.18。考察了各种胞吞途径抑制剂对Tat PTD-Es进入人脐静脉内皮细胞EAHY926的影响。细胞经4℃和NaN3(ATP抑制剂)处理后,与对照组相比,荧光信号大大减弱,荧光强度分别降低了92.49%、94.91%,说明温度、ATP在EAHY926细胞摄取Tat PTD-Es的历程中起到非常重要的作用,其入胞历程是温度、能量依赖的。而经蔗糖(网格蛋白clathrin途径抑制剂)、氯丙嗪(clathrin途径抑制剂)、木黄酮(小窝途径ceolae抑制剂)、细胞松弛素D(巨胞饮途径抑制剂)等不同摄取途径抑制剂处理后的EAHY926细胞对蛋白质的摄取均有所减弱,但是减弱的程度不尽相同。蔗糖及氯丙嗪处理后,荧光强度分别为原来的36.71%及36.86%,均减少了60%左右,提示clathrin途径也可能是Tat PTD-Es入胞机制之一。木黄酮处理后的细胞,荧光强度为原来的66.57%,降低了33%,表明Tat PTD-Es的入胞可能也与ceolae有关。细胞松弛素D处理后的细胞,荧光强度为原来的27.52%,降低了72%,提示巨胞饮也是Tat PTD-Es入胞的潜在途径。由这些结果我们推测,Tat PTD-Es入胞可能不只遵循一种途径,而是几种途径同时有着。4Tat PTD-Es穿透眼球屏障的能力与体内药效学探讨小鼠分组后,分别玻璃体注射和滴眼Tat PTD-Es与Es组,生理盐水滴眼组作为空白对照。取小鼠眼球,切片,用小鼠6×His抗体作为一抗做免疫组化,检测视网膜层是否有目的蛋白。结果显示,玻璃体注射Tat PTD-Es与Es后,视网膜细胞层均有目的蛋白,表明经玻璃体注射后药物能够较快到达视网膜。滴眼给药时,Es组小鼠视网膜细胞层没有目的蛋白的分布,表明通过滴眼给药Es不能到达视网膜,而Tat PTD-Es组小鼠视网膜细胞层出现了目的蛋白,证明通过滴眼给药Tat PTD能够携带Es穿透眼球屏障到达视网膜,达到了我们的预期目的。通过激光烧伤法建立小鼠脉络膜新生血管(CNV)模型,滴眼或玻璃体注射Tat PTD-Es及Es,生理盐水滴眼组作为阴性对照,玻璃体注射Avastin作为阳性对照。实验结果表明,玻璃体注射Tat PTD-Es、Es组的小鼠眼部的CNV血管生成面积分别为(961.2±86.9)μm2和(944.6±88.3)μm2,与阴性药物组(2623.6±240.9)μm2相比CNV面积显著减少(p0.01),且与阳性药物Avastin组(863.5±50.1)μm2相比没有显著性差别。Es滴眼给药时,CNV面积为(2514.7±260.7)μm2,与生理盐水组相比没有显著性差别,表明Es滴眼后Es不能到达眼底,不能抑制CNV的生成。而Tat PTD-Es滴眼给药组的CNV面积(1378.4±154.3)μm2,与阴性药物组相比CNV面积显著减少(p0.01)。滴眼给药Tat PTD-Es能够抑制CNV血管的生成,此结果进一步证明了通过局部滴眼给药后Tat PTD-Es能够穿透眼球屏障到达视网膜脉络膜发挥其作用。本探讨取得的成果和结论：(1)首次构建了Tat PTD-Es的毕赤酵母工程表达菌株。(2)首次构建了表达Tat PTD-Es的大肠杆菌表达系统,对蛋白质成功进行了表达,并对其包涵体进行了复性、纯化,得到了高纯度的目的蛋白。(3)复性纯化的Tat PTD-Es及Es能够显著抑制EAHY926细胞的增殖、CAM血管生成,表明其具有较好的体外活性。(4) Tat PTD-Es比Es具有更好的入胞能力,且其进入EAHY926细胞时遵循多种入胞机制。(5) Tat PTD-Es局部滴眼给药后能够穿透眼球屏障到达眼底视网膜脉络膜组织,且在体内体现出了较好的抑制脉络膜血管生成的活性。关键词：Tat论文PTD论文内皮抑素论文复性论文纯化论文入胞机制论文眼球屏障论文CNV论文
摘要12-16
Abstract16-21
符号说明21-22
第一章 前言22-33
1 内皮抑素22-27
1.1 内皮抑素的起源与进展22-23
1.2 内皮抑素的表达23-24
1.3 内皮抑素的运用24-25
1.4 内皮抑素有着的不足及改善策略25-27
2 Tat蛋白转导域(Tat prtotein transduction domain,Tat PTD)27-31
2.1 Tat PTD起源与结构27-28
2.2 Tat PTD的入胞机制28-30
2.3 Tat PTD的运用30-31
3 本课题的设计思路及拟解决的不足31-33
第二章 Tat PTD-endostatin的制备33-74
第一节 Tat PTD-endostatin在毕赤酵母中的表达纯化33-55
1 材料33-36
1.1 菌株及质粒33-34
1.2 培养基34
1.3 常用溶液配制策略34-35
1.4 试剂与材料35-36
1.5 实验中所用的仪器设备36
2 实验策略36-47
2.1 毕赤酵母表达载体pGAPZαA-Tat PTD-endostatin(pG/TE)的构建36-37
2.2 目的基因的构建37-38
2.3 目的基因的克隆38-41
2.4 表达Tat PTD-Es的毕赤酵母工程菌株的构建41-45
2.5 重组Tat PTD-Es蛋白的表达与鉴定45-46
2.6 重组Tat PTD-Es的分离纯化46-47
3 实验结果47-53
3.1 目的基因的获得47-48
3.2 表达载体的构建与验证48-49
3.3 表达Tat PTD-Es毕赤酵母工程菌株的构建及验证49-51
3.4 重组Tat PTD-endostatin蛋白的表达与鉴定51
3.5 重组Tat PTD-Es蛋白的分离纯化51-53
4. 讨论53-55
第二节 Tat PTD-endostatin在大肠杆菌中的表达、复性及纯化55-74
1 材料55-58
1.1 菌株及质粒55
1.2 培养基55-56
1.3 常用溶液配制策略56-57
1.4 试剂与材料57
1.5 实验中所用的仪器设备57-58
2 实验策略58-66
2.1 大肠杆菌表达质粒pET28a/Tat PTD-endostatin(pET28a/TE)的构建58-59
2.2 目的基因的构建59-60
2.3 目的基因的克隆60-62
2.4表达Tat PTD-Es的大肠杆菌菌株构建62
2.5 Tat PTD-Es在大肠杆菌中的诱导表达62-63
2.6 Tat PTD-Es包涵体复性及纯化63-65
2.7 纯化样品Tat PTD-Es的鉴定65-66
3 实验结果66-71
3.1 大肠杆菌表达质粒pET28a/TE的测序66
3.2 阳性Rossetta菌株的鉴定66-69
3.3 包涵体洗涤条件的摸索69
3.4 蛋白浓度标准曲线69-70
3.5 纯化后样品的鉴定70-71
4 讨论71-74
第三章 Tat PTD-Es的体外活性及入胞机制探讨74-93
1 实验材料74-76
1.1 细胞株及种蛋74
1.2 常用溶液配制策略74-75
1.3 试剂与材料75
1.4 实验中所用的仪器设备75-76
2 实验策略76-80
2.1 Tat PTD-Es及Es对内皮细胞的作用76
2.2 Tat PTD-Es及Es对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用76-78
2.3 Tat PTD-Es的入胞机制考察78-80
3 实验结果80-90
3.1 Tat PTD-Es及Es对内皮细胞的作用80-81
3.2 Tat PTD-Es及Es对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用81-83
3.3 Tat PTD-Es与Es入胞能力的比较83-85
3.4 Tat PTD-Es的入胞机制探讨85-90
4 讨论90-93
第四章 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的能力与体内药效学探讨93-102
1 实验材料93-94
1.1 实验动物93
1.2 常用溶液配制策略93
1.3 试剂与材料93-94
1.4 实验中所用的仪器设备94
2 实验策略94-96
2.1 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的探讨94-95
2.2 Tat PTD-Es对脉络膜新生血管(CNV)的作用95-96
3 实验结果96-100
3.1 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的探讨96-97
3.2 Tat PTD-Es对CNV的作用97-100
4 讨论100-102
总结与展望102-104
1 全文结论102
2 革新点102-103
3 展望103-104
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