摘要：肝脏是体内最大的生物代谢器官，也是外源性物质及其代谢产物攻击的主要靶器官。机体短期接触较大剂量外源性物质可引起急性肝损伤，在外来因素长期作用下，如果不能完全修复，可进展成慢性肝损伤。肝纤维化是各种慢性肝损伤的共有病理变化，其持续进展为肝硬化可引起肝功能衰竭甚至肝细胞癌，已成为一个危害人类生命健康的世界性不足。但目前急慢性肝损伤作用的发病机制尚未完全阐明，仍未发现十分确定、特效的药物，由此，深入探讨急慢性肝损伤的发病机制，为临床寻找理想的抗肝损伤药物，尤其是抗纤维化的药物，具有重要的论述和临床作用。最近探讨发现内质网应激（endoplaic reticulum stress, ER Stress）在许多肝脏疾病中发挥了重要作用。内质网是广泛有着于真核细胞中的一种重要的细胞器，负责蛋白质合成、折叠、组装和运输等。在外来因素刺激作用下，细胞处于应激状态，引起未折叠蛋白反应，它本是机体的一种自我保护机制，但当应激持续发生时，则会激活脂肪生成、炎症和凋亡等途径，引发一系列的病理性反应。最近的一些探讨也显示内质网应激在急慢性肝损伤形成历程中发挥了一定在作用，与肝纤维化的形成密切相关。然而，内质网应激参与急慢性肝损伤，尤其是肝纤维化的确切机制尚未完全阐明。四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl_4）诱导的急慢性肝损伤模型是探讨肝损伤机制的经典模型之一。本探讨首先观察了内质网应激相关蛋白在CCl_4诱导小鼠急性肝损伤中的变化，在此基础上进一步探讨了内质网应激在肝纤维化中的作用及部分机制，主要内容概括如下：1ER stress在CCl_4诱导小鼠急性肝损伤中的作用1.1CCl_4诱导小鼠急性肝损伤为探讨ER stress在小鼠急性肝损伤中的作用，本探讨在经腹腔单次注射CCl_4（0.3ml/kg BW）后不同时点（0,2,6,12,24和72h）分别剖杀小鼠，称量体重和肝脏质量，留取血液和肝脏组织。结果发现：与正常对照组相比，CCl_4在处理后12h小鼠肝重与肝指数显著增加，以72h最显著；CCl_4处理后2h即引起ALT显著升高，24h达最高峰，升高约千倍，72h接近对照组正常值。病理组织学检查显示CCl_4处理6h后，引起显著的气球样变和点状坏死；12h进展为块状坏死；至24h坏死最显著，肝细胞呈大片坏死；72h坏死区域有大量的炎性细胞浸润。1.2CCl_4诱导急性肝损伤小鼠肝脏ER Stress效应为观察急性肝损伤小鼠肝脏ER Stress效应，采取免疫组化技术检测急性肝损伤小鼠肝脏GRP78分布的动态变化。结果发现：与正常对照组相比，在CCl_4处理后2h，在少量肝细胞中出现GRP78棕特异性染色，6h肝细胞特异性染色呈显著的带状分布，12h肝细胞出现区域性特异性染色，24h肝细胞特异性染色分布最广且最深，72h肝细胞GRP78特异性染色显著减弱。采取Western blotting技术检测GRP78蛋白表达以及下游IRE1α、eIF2α蛋白磷酸化水平和ATF6核蛋白水平的动态变化。结果发现：与正常对照组相比，在CCl_4处理后6h肝脏组织GRP78显著升高，在12h达到高峰，并持续至24h，在72h恢复至正常对照水平；在CCl_4处理后2h，肝脏组织IRE1α蛋白磷酸化水平显著升高，至12h肝脏组织IRE1α蛋白磷酸化水平仍显著升高；在CCl_4处理后12h，肝脏组织eIF2α蛋白磷酸化水平显著升高，并持续至72h，以24h磷酸化水平最显著；在CCl_4处理后6h肝脏组织ATF6核蛋白水平显著升高，在24h升高最为显著，在72h恢复至正常对照水平。上面陈述的结果提示CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤模型中发生ER Stress效应。1.3急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的动态变化为观察急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的动态变化，采取TUNEL技术进行检测。结果发现：与正常对照组相比，在CCl_4处理后2至12h，仅有少量肝脏细胞发生凋亡，在24h有大量区域性肝细胞发生凋亡，72h与正常对照组无显著差别。上面陈述的结果提示CCl_4诱导急性肝损伤模型小鼠在CCl_4处理后24h发生大量区域性肝细胞凋亡。1.4内质网应激抑制剂PBA对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响为进一步验证CCl_4诱导急性肝损伤模型小鼠发生肝细胞凋亡是否由内质网应激介导，观察内质网抑制剂PBA对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响，在经腹腔注射给予CCl_4（0.30ml/kg BW）前24h、12h和在CCl_4处理后12h分别经腹腔注射给予150mg/kg PBA进行干预，在CCl_4处理后24h剖杀小鼠，采取TUNEL技术检测肝细胞凋亡。结果发现：与模型组相比，PBA可显著抑制CCl_4诱导的肝细胞凋亡。以上结果提示内质网应激在CCl_4诱导急性肝损伤中发挥了重要作用，可能与其介导的肝细胞凋亡有关。2CCl_4诱导小鼠肝纤维化与ER stress效应2.1CCl_4诱导小鼠肝纤维化模型的建立为建立CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型，每周2次经腹腔注射给予CCl_40.15ml/kg（按10%溶于橄榄油中），共持续8周。结果发现：与正常对照组比较，CCl_4诱导的小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotranerase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotranerase, AST）、碱性磷酸酶（alkapne phosphatase，ALP）水平和总胆红素（Total biprubin，TBIL）、直接胆红素（Direct Biprubin，DBIL）和总胆汁酸（total bipary acid，TBA）含量以及反应肝纤维化程度的组织羟脯氨酸（Hydroxypropne，Hyp）含量均显著增高；病理组织学结果HE染色提示模型组小鼠肝脏中重度坏死，在坏死组织周围有大量的炎症细胞浸润，胶原染色提示肝组织有大量胶原沉积，并分割肝组织形成检测小叶走势。以上结果提示CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型建立成功。2.2CCl_4诱导肝纤维化小鼠肝脏ER Stress效应为观察CCl_4诱导小鼠肝纤维化模型中，是否有着ER Stress效应，采取Westernblotting技术检测ER stress效应标志性蛋白GRP78蛋白表达以及下游IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。结果发现：与正常对照组相比，CCl_4诱导肝纤维化模型小鼠肝脏GRP78蛋白表达显著上调， IRE1α、eIF2α磷酸化水平以及ATF6核蛋白水平显著增加。以上结果提示CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型发生ER stress效应。3内质网应激抑制剂PBA对CCl_4诱导的小鼠肝纤维化的影响为进一步探讨ER stress在CCl_4诱导肝纤维化形成历程中的作用，采取内质网应激抑制剂PBA进行干预，观察ER stress效应被抑制后，对CCl_4诱导小鼠肝纤维化的影响，PBA+CCl_4干预组，在每周2次经腹腔注射给予0.15ml/kg CCl_4的同时，每天两次经腹腔注射给予150mg/kg PBA，共持续8周。结果发现：与肝纤维化模型组相比，PBA干预显著降低小鼠肝重和肝指数，并显著降低血清DBIL、TBA水平和肝组织Hyp含量；病理学组织结果，PBA干预显著减轻肝脏组织炎症细胞数量与肝脏坏死程度，改善肝组织结构，减少胶原沉积。α-A是肝星状细胞激活的标志，采取免疫组化技术和Western blotting技术浅析α-A蛋白表达。结果发现：与模型组比较，PBA干预显著降低小鼠肝脏α-A的蛋白表达。采取实时定量RT-PCR技术检测肝纤维化关键性细胞因子TGF-β1mRNA水平，结果发现：与模型组相比较，PBA干预显著降低TGF-β1mRNA水平。采取实时定量RT-PCR技术检测肝脏胶原标志物Col1a1和Col1a2mRNA水平以及胶原降解相关蛋白基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中Mmp2和Mmp9mRNA、金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor ofmetallopeptidases，TIMPs）中Timp1和Timp2mRNA水平。结果发现，与正常对照组相比，肝纤维化模型组小鼠Col1a1、Col1a2、Mmp2、Mmp9、Timp1、Timp2mRNA水平显著增加；与模型组相比，PBA干预显著抑制Colla1、Colla2、Mmp2和Timp1mRNA水平。以上结果提示：内质网应激可能与增加小鼠肝脏胶原纤维表达有关。为进一步验证ER stress在CCl_4诱导肝纤维化中的作用，采取内质网应激抑制剂PBA进行干预，观察对肝纤维化小鼠的ER stress效应的影响，采取Western blotting技术检测GRP78蛋白表达、IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。结果发现：与模型组相比，PBA干预显著抑制CCl_4诱导的肝纤维化小鼠肝脏GRP78蛋白表达的上调作用，降低IRE1α、eIF2α磷酸化水及核蛋白ATF6水平。以上结果进一步提示PBA可以抑制CCl_4诱导的肝脏内质网应激和未折叠蛋白反应，进一步证明内质网应激在肝纤维化的形成历程中发挥了重要的作用。4ER stress在CCl_4诱导的小鼠肝纤维化中的作用机制4.1ER stress介导的NF-κB信号通路在CCl_4诱导小鼠肝纤维化中的作用为进一步探讨ER stress在CCl_4诱导的小鼠肝纤维化中的作用机制，采取Western blotting和实时定量RT-PCR技术检测CCl_4诱导的肝纤维化模型组以及内质网应激抑制剂干预组对NF-κB信号通路的影响。结果发现：与正常对照组相比，CCl_4诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏细胞核转录因子NF-κB p65核蛋白水平显著增加；与模型组相比，PBA干预显著降低细胞核内NF-κB p65核蛋白水平。采取实时定量RT-PCR技术检测NF-κB信号通路下游靶基因TNF-α mRNA水平，结果显示：肝纤维化模型组小鼠肝脏TNF-α mRNA水平显著增高；与模型组相比，PBA干预显著降低TNF-α mRNA水平。以上结果提示ER stress在CCl_4诱导肝纤维化小鼠中的作用机制，可能与其介导的NF-κB信号通路及炎症反应有关。4.2ER stress介导的MAPKs信号通路在CCl_4诱导小鼠肝纤维化中的作用为进一步探讨内质网应激在CCl_4诱导的小鼠肝纤维化作用中的机制，采取Western blotting技术检测CCl_4诱导的肝纤维化模型组以及内质网应激抑制剂干预组对MAPKs信号通路的影响。结果发现：与正常对照组相比，CCl_4诱导的肝纤维化模型组小鼠ERK和JNK磷酸化水平显著增加，而p38的磷酸化水平显著降低；与模型组相比，PBA干预显著降低肝脏ERK和JNK的磷酸化水平，对肝脏磷酸化的p38的表达无显著影响。以上结果提示ER stress在CCl_4诱导的小鼠肝纤维化形成历程中的作用机制，可能与其介导的ERK和JNK信号通路有关。以上实验结果综合表明，ER stress在CCl_4诱导的急性肝损伤发挥了重要的作用，可能与其介导的肝细胞凋亡有关；ER stress在CCl_4诱导的慢性肝损伤——肝纤维化历程中也起了十分重要的作用，其作用机制可能与其介导的NF-κB信号通路和JNK、ERK信号通路有关。更为重要的是，ER stress效应被抑制后，对肝纤维化具有一定保护作用，提示内质网应激可为开发防治肝纤维化疾病的药物提供新的作用靶点和思路。关键词：内质网应激论文未折叠蛋白反应论文CCl4论文急性肝损伤论文肝纤维化论文核因子κB/丝裂原活化蛋白激酶论文4-丁酸论文
英文缩略词表7-9
中文摘要9-15
Abstract15-22
1 前言22-24
2 实验材料24-27
3 实验策略27-39
4 结果39-81
4.1 ER stress 在 CCl_4诱导小鼠急性肝损伤中的作用39-49
4.1.1 CCl_4诱导小鼠急性肝损伤模型39-42
4.1.1.1 急性肝损伤小鼠肝重与肝指数的变化39-40
4.1.1.2 急性肝损伤小鼠血清 ALT 水平的变化40-41
4.1.1.3 急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学的变化41-42
4.1.2 CCl_4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏ER Stress效应42-47
4.1.2.1 急性肝损伤小鼠肝脏 GRP78 分布的变化42-43
4.1.2.2 急性肝损伤小鼠肝脏 GRP78 蛋白表达的变化43-44
4.1.2.3 急性肝损伤小鼠肝脏 IRE1α蛋白磷酸化水平的变化44-45
4.1.2.4 急性肝损伤小鼠肝脏 eIF2α蛋白磷酸化水平的变化45-46
4.1.2.5 急性肝损伤小鼠肝脏 ATF6 核蛋白水平的变化46-47
4.1.3 急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的动态变化47-48
4.1.4 内质网应激抑制 PBA 对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响48-49
4.2 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化与 ER stress 效应49-58
4.2.1 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型建立49-54
4.2.1.1 肝纤维化小鼠肝重与肝指数的变化49-50
4.2.1.2 肝纤维化小鼠血清 ALT、AST 和 ALP 水平的变化50
4.2.1.3 肝纤维化小鼠血清 TBIL、DBIL 和 TBA 水平的变化50-51
4.2.1.4 肝纤维化小鼠肝脏 Hyp 含量的变化51-52
4.2.1.5 肝纤维化小鼠肝脏病理组织学的变化52-54
4.2.2 CCl_4诱导肝纤维化小鼠 ER stress 效应54-58
4.2.2.1 肝纤维化小鼠肝脏 GRP78 的表达变化54-55
4.2.2.2 肝纤维化小鼠肝脏 IRE1α磷酸化水平的变化55-56
4.2.2.3 肝纤维化小鼠肝脏 eIF2α磷酸化水平的变化56-57
4.2.2.4 肝纤维化小鼠肝脏 ATF6 核蛋白水平的变化57-58
4.3 内质网应激抑制剂 PBA 对 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化的影响58-76
4.3.1 PBA 对肝纤维化小鼠肝重和肝指数的影响58
4.3.2 PBA 对肝纤维化小鼠血清 ALT、AST 和 ALP 水平的影响58-59
4.3.3 PBA 对肝纤维化小鼠血清 TBIL、DBIL 和 TBA 水平的影响59-60
4.3.4 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 Hyp 含量的影响60-61
4.3.5 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏病理组织学的影响61-65
4.3.6 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏α-A 表达的影响65-68
4.3.7 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 TGF-β1mRNA 表达的影响68-69
4.3.8 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏胶原表达的影响69-72
4.3.8.1 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 Col1a1 和 Col1a2 mRNA 表达的影响69-70
4.3.8.2 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 Mmp2 和 Mmp9 mRNA 表达的影 响70-71
4.3.8.3 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 Timp1 和 Timp2 mRNA 表达的影 响71-72
4.3.9 内质网应激抑制剂 PBA 对 CCl_4诱导肝纤维化小鼠 ER stress 的影响72-76
4.3.9.1 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 GRP78 表达的影响72-73
4.3.9.2 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 IRE1α磷酸化水平的影响73-74
4.3.9.3 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 eIF2α磷酸化水平的影响74-75
4.3.9.4 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 ATF6 核蛋白水平的影响75-76
4.4 ER stress 在 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化中的作用机制76-81
4.4.1 ER stress 介导的 NF-κB 信号通路在 CCl_4诱导小鼠肝纤维化中的作用76-78
4.4.1.1 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 NF-κB 核蛋白水平的影响76-77
4.4.1.2 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 TNF-α mRNA 水平的影响77-78
4.4.2 ER stress 介导 MAPKs 信号通路在 CCl_4诱导小鼠肝纤维化中的作用78-81
4.4.2.1 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 ERK 磷酸化水平的影响78-79
4.4.2.2 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 JNK 磷酸化水平的影响79-80
4.4.2.3 PBA 对肝纤维化小鼠肝脏 p38 磷酸化水平的影响80-81
5 讨论81-90
6 结论90-91
7 参考文献91-98
附录98-101
致谢101-103
综述103-129
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