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摘要：缺血性脑卒中即为广义的脑梗塞,是指突然发生的脑组织局部供血动脉血流灌注减少或血流完全中断,停止供血、供氧、供糖等,使该局部脑组织崩解破坏。缺血性脑卒中成为当今世界成年人死亡和致残的主要理由之一,其高死亡率、高致残率越来越受到人们关注。在众多治疗脑梗死的措施中,溶栓治疗是唯一被认为确切有效的办法,但由于其治疗时间窗较短和高出血风险,限制了其在临床的运用。探讨发现：在局灶性脑缺血后较长时间内脑损伤仍进行性加重,脑缺血组织周边有着显著炎性免疫反应,其轻重与缺血后神经损害程度密切相关。甚至Acalovschi等认为：在脑缺血急性期,缺血区炎性反应对脑组织的损伤要比缺血本身更为严重。另一种观点指出,缺血性脑卒中后由于血一脑屏障破坏和组织破坏致使脑的抗原表位暴露给免疫系统,以而可造成自身免疫性损伤。有探讨指出：提前诱导对神经系统抗原鞘磷脂碱蛋白(MBP)的免疫耐受可抑制神经系统的自身免疫反应,而且可以改善脑卒中结果。通常认为中枢神经系统中“促炎反应”具有神经破坏作用,而“抑炎反应”具有神经保护作用。抑制脑缺血后的“炎性免疫反应”或“自身免疫反应”可能会成为今后治疗和改善急性脑缺血损伤的重要靶点,然而目前关于脑缺血后炎性免疫反应的机制尚未完全阐明,特别是急性脑缺血后的“抑炎反应”的探讨目前仍较少,由此有必要对脑缺血后炎症免疫反应的调控机制行进一步的探讨。调节性T细胞(Treg细胞)是一批具有独特免疫调节功能的T细胞亚群,以调剂自身T细胞反应为主要功能,此类细胞同时具有免疫无能性和免疫抑制功能两大特点。它能够抑制自身反应性T细胞的表达、阻止自身免疫性疾病的发生、免疫无能、维持自身免疫耐受等,在维持外周免疫耐受和抑制炎症反应发生中具有不可替代的作用。其中CD4+CD25+调节性T细胞为目前探讨较为深入的Treg细胞,目前认为该群细胞最具特异的标志是叉头翼螺旋转录因子Foxp3,其在CD4+CD25+调节性T细胞的产生和功能发挥方面都起到决定性的作用。探讨指出TGF-β1是有CD4+CD25+调节性T细胞分泌产生的一种具有免疫抑制作用的细胞因子,同时TGF-β1在诱导CD4+CD25+调节性T细胞的产生和维持作用的发挥中起关键作用。体内探讨发现高表达TGF-β1转基因小鼠的外周血和胸腺中CD4+CD25+T细胞的表达增加,体外探讨指出将TGF-β1与CD4+CD25+T细胞共培养,发现能增强CD4+CD25+T细胞的免疫抑制性功能。近年来Treg细胞已在自身免疫疾病、肿瘤、器官移植、病毒性感染等疾病领域中已经展开了广泛的探讨,尤其是CD4+CD25+调节性T细胞已经成为目前探讨的热点话题。然而就目前国内外探讨情况而言,CD4+CD25+调节性T细胞在缺血性脑卒中方面的的探讨较少。已知脑缺血组织周边有着显著炎性反应,是加重脑缺血损伤的理由之一。CD4+CD25+调节性T细胞是一种具有免疫抑制作用的细胞,那么CD4+CD25+调节性T细胞是否参与急性脑缺血的发生进展?具体作用是什么目前仍不太清楚。探讨已经指出TGF-β1能诱导体内外CD4+CD25+T细胞的表达及作用的发挥,那么在脑缺血发生进展的病理演变历程中,TGF-β1是否同样与CD4+CD25+T细胞的表达息息相关呢?目的动态观察大鼠急性脑缺血后不同时期外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和TGF-β1的表达情况,探讨二者之间的相关性,观察脑缺血灶病理形态学特点,同时观察脑组织中Foxp3的表达与脑缺血灶形成的联系以及外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达与神经功能损伤的相关性,以探讨CD4+CD25+调节性T细胞在急性缺血性卒中病理生理演变历程中的作用以及调节通路。48只Wistar大鼠按随机数字表法分为脑缺血组和检测手术组,每组各24只。参考改良的Zea-Longer插线策略将缺血组大鼠制作成右侧大脑中动脉线栓脑缺血动物模型。分别采取流式细胞术和ELISA法检测造模后1d、3d、7d、14d时大鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和TGF-β1的表达情况,采取HE染色观察脑缺血灶病理形态学特点,采取免疫组化法观察两组大鼠脑组织中Foxp3的表达,同时采取改良NSS神经功能缺损评分观察两组大鼠行为学变化,并做CD4+CD25+调节性T细胞与TGF-β1、NSS之间的相关浅析。结果1、流式细胞术结果显示,急性脑缺血后的1d、3d、7d、14d CD4+CD25+调节件T细胞的表达有逐渐增高走势,在这4个时间点中CD4+CD25+调节性T细胞的表达只有1d、3d差别无统计学作用(P0.05),其它时间均有显著统计学作用(P0.05)。外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达在脑缺血后的1d、3d时与检测手术组比较差别无统计学作用(P0.05),到7d、14d时其表达显著高于检测手术组,差别有统计学作用(P0.05)。2、ELISA法结果显示,外周血中TGF-β1的表达在脑缺血后的1d时与检测手术组比较差别无统计学作用(P0.05),到3d时其表达开始较检测手术组增高(P0.05),到7d、14d时其表达显著高于检测手术组,差别有统计学学作用(P0.05)；急性脑缺血后的1d、3d、7d、14d TGF-β1的表达同样有逐渐增高走势,且各个时间点相互之间的差别有统计学作用(P0.01)。3、HE染色显示,缺血组大鼠脑组织可见梗死灶,呈典型的缺血性转变,神经元胞体缩小,胞核固缩、深染,病变部位与周围组织界线清楚,坏死中心区可见大量神经细胞缺血坏死,神经元外形不易辨认,大部分细胞结构消失,胞浆空泡样变性,神经细胞数目显著减少,坏死灶内大量胶质细胞增生。检测手术组大鼠脑组织中神经元形态结构正常,未见显著的病理性损伤。4、免疫组化染色结果显示,在脑缺血后的1d、3d、7d、14d的脑组织中均可观察到Foxp3的表达,且主要集中在缺血灶及周边区域,在脑缺血组的未缺血区域也可以观察到Foxp3的表达,而检测手术组脑组织未形成缺血灶,未见Foxp3的表达。5、神经功能评分结果显示,两组大鼠的神经功能缺损评分差别在脑缺血后的1d、3d、7d、14d均有显著统计学作用(P0.01)。6、相关浅析显示,急性脑缺血后的1d、3d、7d、14d TGF-β1的表达逐渐增加,与CD4+CD25+调节性T细胞的表达呈正相关(r=0.822,p=0.000)；各个时间点的相关浅析显示,除在脑缺血后1d时CD4+CD25+调节性T细胞与TGF-β1的表达无显著相关之外,余各个时间点均有着正相关联系：1d(r=0.9757,p=0.138)、3d(r=0.921,p=0.027)、7d(r=0.886,p=0.045)、14d(r=0.920,p=0.027)；随着脑缺血时间延长,急性脑缺血后的神经功能评分均逐渐下降,与CD4+CD25+调节性T细胞的表达呈负相关(r=-0.820,p=0.01),各个时间点的相关浅析显示：CD4+CD25+调节性T细胞的表达与神经功能缺损评分在脑缺血后的1d、3d、7d、14d均有着负相关联系：1d(r=-0.885,p=0.019)、3d(r=-0.878,p=0.022)、7d(r=-0.690,p=0.029)、14d(r=-0.911,p=0.012)结论1、CD4+CD25+调节性T细胞在急性脑缺血后的不同时期有着着动态变化,提示CD4+CD25+调节性T细胞参与大鼠急性脑缺血后病理生理的发生进展历程。2、脑缺血后可出现神经元胞体缩小,胞核固缩、深染、大量神经细胞缺血坏死,神经元外形不易辨认,大部分细胞结构消失,胞浆空泡样变性,神经细胞数目显著减少,坏死灶内大量胶质细胞增生等现象。3、脑组织中Foxp3的表达与脑缺血灶的形成密切相关,Foxp3的表达严格集中在梗塞灶及周边区域,提示CD4+CD25+调节性T细胞参与脑组织的缺血损伤和修复历程。4、CD4+CD25+调节性T细胞的表达与神经功能损伤程度呈负相关,提示CD4+CD25+调节性T细胞在急性脑缺血后的免疫调节中可能具有保护作用。5、TGF-β1在急性脑缺血后的不同时期同样有着着动态变化,且与CD4+CD25+调节性T细胞的表达有着着正相关,提示TGF-β1可能是诱导急性脑缺血后CD4+CD25+调节性T细胞表达的调节通路。关键词：脑缺血论文CD4~+CD25~+调节性T细胞论文Foxp3论文TGF-β1论文调节通路论文
摘要3-8
ABSTRACT8-16
前言16-19
材料与策略19-26
1 材料19-20
2 策略20-26
结果26-37
3.1 模型评定结果26-27
3.2 神经功能缺损评分结果27-28
3.3 外周血中CD4~+CD25~+调节性T细胞的表达28-29
3.4 缺血脑组织的形态学转变29-30
3.5 脑组织中Foxp3的表达30-32
3.6 外周血中TGF-β1的表达32-35
3.7 相关性浅析35-37
讨论37-48
4.1 动物的选择与模型的设计37-39
4.2 脑缺血后脑组织梗死灶的分布特点及病理形态学浅析39-40
4.3 急性脑缺血后炎症免疫反应的机制40-41
4.4 CD4~+CD25~+调节性T细胞在急性脑缺血后的表达情况及相关作用的探讨41-44
4.5 TGF-β1对CD4~+CD25~+调节性T细胞在急性脑缺血后免疫调节中的作用探讨44-45
4.6 小结45-48
结论48-50