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简论急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TMEM16A表达

收藏本文 2024-02-27 点赞:22348 浏览:97366 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是机体遭受各种打击时引起的以肺泡毛细血管通透性增加为特点的肺部炎症综合征,发病急、病情重,未经有效治疗可以进展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome,ARDS)。临床体现为难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺动脉高压而体循环低血压。尽管目前对其治疗措施已有很大进展,其死亡率仍在50%左右。急性肺水肿(acute pulmonary edema,APE)是ALI/ARDS的主要病理生理特点。临床探讨表明:早期清除ARDS患者肺泡内的液体是其治疗的关键。肺泡液体清除率(alveolar fluid clearanceAFC)与肺水肿联系密切,肺泡上皮细胞转运功能正常对于肺水的清除十分重要,增加肺泡液体清除率可以推动肺水肿的吸收。肺泡液体清除是肺泡上皮的主要功能之一。肺泡上皮细胞由扁平的肺泡Ⅰ型细胞(ATⅠ)和立方形的肺泡Ⅱ型细胞(ATⅡ)组成,其主要功能在于清除肺泡内多余液体,保持肺泡相对干燥,维持气体的正常交换。肺泡上皮细胞上有着的多种离子通道参与了肺水的液体转运。在众多的离子通道中钠离子通道对于肺泡液体清除的作用已经被证实。水通道也已被证实有着于ATⅡ,且水通道蛋白1(AQP1)在ARDS状态下表达显著下降,朱丽华等在实验中证实水通道蛋白4(AQP4)在ARDS状态下表达增加。尽管氯离子通道在体内含量丰富,但是关于其与肺泡液体清除的探讨却很少。囊性纤维化跨膜传导调节体(Cystic Fibrosis Trans-membrane conductance Regulator CFTR)氯离子通道是一种cAMP依赖性蛋白激酶和ATP调节的氯离子通道,已被证实有着于肺泡上皮细胞。谷秀等探讨发现β-受体激动剂和CFTR通道激动剂均可提升离体大鼠的AFC,且前者提升AFC的作用部分是通过CFTR完成的。多项探讨表明CFTR在肺泡液体的清除历程中发挥作用。但最近发表的报道未显示β2-受体激动剂改善ARDS预后的效应,说明影响因素复杂。TMEM16A是在2008被发现的钙激活的氯离子通道,其在ALI中的作用尚未被人们所了解,本实验中选取TMEM16A为探讨对象。通过静脉注射LPS建立ALI模型,分离并纯化ATⅡ,并在细胞水平检测TMEM16A的表达变化。策略:选取清洁级健康雄性SD大鼠24只,体重在180-220g,将其随机分为2组:正常对照组,LPS模型组。每组6只大鼠用于肺组织病理学检查,6只用于检测TMEM16A的表达。LPS组经尾静脉注射LPS(8㎎/㎏),对照组注射生理盐水,2小时后取材。麻醉后经股动脉放血取新鲜肺组织。取左肺叶用10%溶液固定留作病理观察。按照经典的策略并加以改善提取ATⅡ。将大鼠麻醉后行气管切开,经肺动脉插管,行肺动脉灌洗的同时行肺通气。之后将肺组织移出胸腔,用胰蛋白酶和胶原酶对肺组织进行消化。之后剪碎肺组织,过滤细胞悬液。对细胞悬液进行离心并调节细胞浓度,进行体外培养。运用IgG免疫粘附法纯化ATⅡ,运用电镜观察和P染色法对ATⅡ进行鉴定。通过酶联免疫吸附法测定细胞培养上清液中IL-1β的水平,免疫印迹法检测TMEM16A的表达。结果:1病理结果:正常组HE染色可见肺结构完整,各处肺泡间隔厚度正常均一。血管腔内未见红细胞渗出,无灶性肺不张,仅有少量粒细胞浸润。LPS模型组HE染色可见肺间质及肺泡内炎性细胞浸润,肺间质增宽,肺间质渗液显著,毛细血管内淤血。光镜下肺组织病理评分LPS组(9.42±0.72)显著高于正常对照组(0.70±0.52)(P0.01)。2ATⅡ的分离、纯化和鉴定:通过电镜和P染色鉴定大鼠ATⅡ。电镜下观察正常大鼠ATⅡ,可见其形状规则,呈立方形或圆形,表面可见长短不一的微绒毛,胞质内可见板层小体等特点性结构。LPS组纯化后可获得(1.35±0.04)×107个细胞。经台盼蓝染色后LPS组细胞活力达(83±2.32)%。3ELISA结果:LPS组细胞培养液中IL-1β的水平(33.33±2.48)显著高于正常组(14.68±0.95)(P0.01)4Western blotting结果:TMEM16A蛋白表达水平正常组(1.01±0.10)与LPS组(1.00±0.07)之间无统计学差别(P0.05)。结论:1通过静脉注射LPS可以造成大鼠的急性肺损伤,本实验成功复制了ALI模型。2适当的消化酶浓度、时间对于ATⅡ的分离至关重要。用IgG免疫粘附法可以提升ATⅡ的纯度。电镜下可以观察到ATⅡ的典型结构板层小体。3在急性肺损伤中,ATⅡ分泌IL-1β的量显著增加,ATⅡ上氯离子通道TMEM16A的表达没有显著变化。关键词:TMEM16A论文急性肺损伤论文肺泡Ⅱ型上皮细胞论文白介素IL-1β论文脂多糖论文

    摘要4-7

    ABSTRACT7-11

    前言11

    材料与策略11-21

    结果21-24

    附图24-28

    附表28-29

    讨论29-34

    结论34

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