试谈李斯特单核细胞增生李斯特菌PCR检测策略和试剂盒建立站

摘要：单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性致病菌，可导致李斯特菌病，致死率高达20%~30%，建立特异、灵敏和高效的检测策略用于单核细胞增生李斯特菌的检测与制约具有重要作用。采取传统培养策略检测单核细胞增生李斯特菌，操作复杂且耗时，难以满足当今食品安全检测的需要。基于聚合酶链式反应（PCR）的检测策略具有快速、灵敏和准确的特点。目前，单核细胞增生李斯特菌PCR检测靶点主要来自于毒力基因。采取现有的这些靶点建立的PCR系统，可能因靶点特异性不强而容易出现检测阳性结果或因毒力基因突变或丢失而出现检测阴性结果。随着生物信息学技术的进展和细菌基因组序列的不断增加，特别是有4株单核细胞增生李斯特菌全基因组序列的公布，为寻找那些毒力基因之外的特异性检测靶点提供了条件。由此，本探讨以生物信息学比对浅析为手段，发掘特异性检测靶点并建立PCR检测策略，主要内容如下：1、单核细胞增生李斯特菌检测靶点的发掘。通过比较基因组浅析策略（以500bp片段或CDS片段为基本切割单位）对该菌全基因组序列进行比对浅析，筛选特异性靶点并设计引物。经过28株单核细胞增生李斯特菌和60株非单核细胞增生李斯特菌菌株的评价与验证，共得到3对高特异性扩增引物，分别对应单核细胞增生李斯特菌EGD-e菌株中的3个基因：lmo0877基因，lmo0834基因及lmo0754基因。其中根据lmo0754基因序列设计的引物lmo0754具有高灵敏度，基因组DNA的检测限为55拷贝/PCR。2、含内标的PCR检测系统。利用筛选的引物lmo0754建立和优化了含内标的PCR检测系统。内标构建采取复合引物法，其序列是一段来源于高等植物红豆杉中的紫杉二烯合成酶基因序列（txs）。经优化后确定退火温度Tm值和Mg2+浓度分别为56℃和1.5mmol/L。经过优化，当反应系统中内标含量为105拷贝时，建立的PCR系统检测基因组DNA的灵敏度为55拷贝/PCR。通过人工污染牛奶样品实验验证了该检测系统，结果表明：当初始接种量为1~10CFU/mL时，经一步增菌(选择性培养基UVM)，6~9h就可获得阳性检测结果，表明所建立的检测系统具有快速、灵敏的特点。3、荧光定量PCR检测试剂盒的研制。特异性实验结果表明，该试剂盒能够准确检测单核细胞增生李斯特菌，与其它致病菌无交叉反应。灵敏度实验结果表明，试剂盒检测基因组DNA灵敏度为3.94fg/反应；重复性试验结果表明，试剂盒的批内、批间平均变异系数分别为2.2%和1.9%；稳定性试验结果表明，反复冻融处理40次对试剂盒检测效果无显著影响，可在-20℃下避光保存1年。由此，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适合于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。关键词：单核细胞增生李斯特菌论文PCR论文分子靶点论文扩增内标论文荧光定量PCR论文试剂盒论文

摘要6-9

ABSTRACT9-17

1 绪论17-39

1.1 单核细胞增生李斯特菌与李斯特菌病17-20

1.1.1 单核细胞增生李斯特菌生物学特点17-18

1.1.2 单核细胞增生李斯特菌的分布18

1.1.3 李斯特菌病的临床特点18-19

1.1.4 李斯特菌病的流行病学调查19-20

1.2 单核细胞增生李斯特菌检测技术探讨进展20-25

1.2.1 传统分离鉴定策略20-21

1.2.2 免疫学检测策略21

1.2.3 核酸探针检测策略21-22

1.2.4 PCR 检测策略22-25

1.3 单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测靶点25-27

1.4 扩增内标在 PCR 检测技术中的运用27-31

1.4.1 PCR 产物突变法28-29

1.4.2 复合引物法29-30

1.4.3 重叠 PCR 技术30-31

1.5 生物信息学策略发掘检测靶点31-32

物信息学发掘检测靶点及引物设计45-48

2.1.6 PCR 反应系统48

2.1.7 特异性评价48

2.1.8 灵敏度评价48-49

2.2 结果49-57

2.2.1 检测靶点的挖掘49-51

2.2.2 特异性评价51-54

2.2.3 灵敏度评价54-57

2.3 讨论57-59