简析血红素大肠杆菌5氨基乙酰丙酸合成途径改造与其对菌体代谢影响初步站

摘要7-8

ABSTRACT8-10

缩略词表10-11

第一章 绪论11-16

1. 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevupnic acid,ALA)11-16

1.1 ALA介绍11-12

1.1.1 ALA的合成11-12

1.1.2 ALA C5合成途径的调控12

1.2 血红素12-14

1.2.1 血红素的生物功能12-13

1.2.2 血红素的生物合成途径与代谢13-14

1.3 大肠杆菌氨基酸转运系统14-15

1.3.1 大肠杆菌氨基酸的转运14

1.3.2 知的大肠杆菌ALA转运系统14-15

1.4 HemB的抑制因子YicL15

1.5 SsrA(tmRNA)蛋白降解标签15

1.6 转录组学浅析技术15-16

第二章 ALA产量提升的多点尝试16-40

1. 引言16-17

2. 实验材料17-21

2.1 菌株与质粒17-18

2.2 引物18-19

2.3 生化试剂及试剂盒19-20

2.4 仪器与设备20

2.5 培养基及组成20-21

3. 实验策略21-30

3.1 构建表达rhtA和yeaS的质粒21-25

3.1.1 引物设计21

3.1.2 大肠杆菌基因组的提取21

3.1.3 扩增rhtA和yeaS基因21-22

3.1.4 PCR产物的纯化22

3.1.5 pCL1920载体质粒的提取22

3.1.6 限制酶切目的基因和质粒载体22-23

3.1.7 体外连接目的基因和质粒载体23

3.1.8 大肠杆菌化学感受态的制备23

3.1.9 大肠杆菌的化学转化23-24

3.1.10 重组子的筛选与鉴定24-25

3.2 mppA及dppA基因的敲除25-26

3.2.1 敲除引物的设计与基因敲除片段的扩增25

3.2.2 大肠杆菌基因敲除感受态的制备25

3.2.3 大肠杆菌电转化基因敲除25

3.2.4 阳性克隆的筛选25-26

3.2.5 pDK46质粒与筛选抗性基因的消除26

3.3 构建过表达yicL的质粒菌株与质粒26-27

3.4 构建表达hmuO_(c.g)的大肠杆菌菌株27

3.5 HemB蛋白弱化菌株的构建27-29

3.5.1 构建HemB蛋白弱化的菌株27-28

3.5.2 敲除sspB基因28-29

3.6 菌株的构建与保存29

3.7 ALA发酵的制约与产物的检测29-30

3.7.1 发酵培养制约流程29

3.7.2 发酵产物的检测29-30

4. 实验结果30-38

4.1 敲除ALA吸收系统不能推动ALA的积累30-31

4.2 RhtA可以分泌ALA,推动ALA生产菌株积累ALA31-32

4.3 YeaS不能分泌ALA32-33

4.4 YeaS和RhtA的二级结构33-35

4.5 表达HemB抑制因子不能推动ALA的积累35

4.6 表达谷氨酸棒杆菌的血红素氧化酶编码基因不能推动ALA的积累35-36

4.7 大肠杆菌HemB蛋白的弱化引起ALA产量的降低36-37

4.8 sspB基因的敲除可以部分回补HemB蛋白弱化引起的ALA产量的降低37-38

4.9 低拷贝表达hemB基因不能推动ALA的积累38

5. 讨论与总结38-40

第三章 C5途径加强对大肠杆菌及谷氨酸棒杆菌部分主要代谢产物的影响40-53

1. 引言40

2. 实验材料40-42

2.1 引物41

2.2 培养基41-42

3. 实验策略42-46

3.1 相关代谢产物的浅析策略42-44

3.1.1 乙酸,丙酮酸等有机酸的浅析42

3.1.2 谷氨酸的浅析42

3.1.3 血红素的测定策略42-44

3.2 构建表达粘质沙雷氏菌血红素外膜受体蛋白的质粒44-45

3.3 谷氨酸棒杆菌感受态制备以及转化45-46

3.4 谷氨酸棒杆菌发酵ALA的实验操作46

4. 结果46-52

4.1 在大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引起乙酸积累,生长及耗糖的变化46-47

4.2 大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引血红素含量的增加47-48

4.3 在大肠杆菌中过表达hemA,hemL基因引呼吸速率的加速48

4.4 在谷氨酸棒杆菌中过表达hemA,hemL引起谷氨酸的积累48-50

4.5 在谷氨酸棒杆菌表达hemA,hemL引起卟啉类物质的积累50

4.6 外源添加氯高铁血红素引起大肠杆菌乙酸积累的变化50-51

4.7 外源添加ALA与氯高铁血红素不能推动谷氨酸的积累51-52

5. 总结与讨论52-53

第四章 HemB蛋白弱化对菌体全局转录水平的影响53-79

1. 引言53-55

2 实验材料55-56

3 实验策略56-62

3.1 提取大肠杆菌总RNA用于转录组测序浅析56-57

3.2 华大基因转录组浅析的流程57-61

3.3 大肠杆菌总tRNA的提取策略61-62

4 实验结果62-77

4.1 DAL及DsAL合成ALA能力的体外测定62-64

4.2 转录组学浅析结果64-69

4.3 大肠杆菌HemB弱化前后生长状态,耗糖及产乙酸的差别69-71

4.4 大肠杆菌产谷氨酸能力的差别71-72

4.5 大肠杆菌血红素含量的差别72

4.6 HemB弱化对外源途径生产ALA能力的影响72-73

4.7 添加氯高铁血红素对ALA积累的影响73-74

4.8 添加氯高铁血红素对菌体生长及葡萄糖消耗的影响74-75

4.9 添加氯高铁血红素对菌体乙酸积累的影响75-76

4.10 DH5α,DBs,DAL及DsAL呼吸速率的测定76-77

5 讨论与总结77-79

全文总结79-80