摘要：井冈霉素是我国自主开发、运用面积最广、产业化最为成功的农用抗生素之一，主要用于防治水稻纹枯病，同时也是糖尿病治疗药物伏格列波糖合成的重要前体，具有较高的产品附加值。井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种是上世纪70年代由沈寅初院士以井冈山地区分离到的，其正常生长温度为30℃，但在发酵温度为37℃时，产量有大幅度提升。在摇瓶发酵条件下，实验室菌株5008的产量约为2克/升，经过四十年的传统诱变育种，其衍生的工业菌株TL01产量达到18克/升，在工厂发酵罐中甚至高达30克/升，发酵周期仅为2天。由此，该类菌株具有产量高、发酵温度高和发酵周期短等优良特性，这为通过比较功能基因组学探讨揭示井冈霉素的高产机制提供了极佳的探讨材料。本论文主要分为以下四个部分。第一部分井冈霉素产生菌5008基因组完整图谱的构建与剖析利用454测序技术测定了菌株5008的基因组序列，利用各种文库（6-8kb质粒文库和foid文库）末端序列信息、数据浅析与基本分子生物学实验进行了草图中缺口的填补，并结合特殊的末端片段克隆策略识别了5008基因组的四个端粒，成功构建了5008基因组的完整图谱。除了大小为10,145,833bp线型染色体外，通过脉冲场电泳还发现了164,566bp的线型质粒，同时结合大质粒提取和电泳浅析还确认了73,285bp的环型质粒。链霉菌基因组的比较浅析发现，5008染色体有着相对较小的核心区（5.56Mb）、最短的末端反向重复序列（14bp），并编码了更多（比例）的α/β水解酶、MFS转运蛋白和镁离子/锰离子依赖的磷酸酶。还编码了29个聚酮（PKS）、非核糖体肽类（NRPS）、杂合聚酮-多肽（PKS-NRPS）、萜类（terpene）、硫肽类（lantibiotic）等次级代谢产物，其中只有井冈霉素和环噻唑霉素合成基因簇得到确认。另外，我们重建了井冈霉素合成前体相关的初级代谢通路，碳源前体为7-磷酸景天庚酮糖和UDP-葡萄糖，氮源前体可能为谷氨酸。浅析发现5008有着两个UDP-葡萄糖合成酶的编码基因（ugp），用于提供糖基合成井冈霉素，而其它已测序的链霉菌只编码一个ugp。第二部分井冈霉素生物合成温度调控的转录组探讨通过基因组芯片技术，我们浅析了5008在30℃与37℃条件下的转录谱变化，在37℃分别有701个上调和841个下调的差别表达基因。鉴于阿维链霉菌NRRL8165与5008有着更多的同源基因，且不有着抗生素合成的温度调控现象，我们开展了在同样发酵条件下的NRRL8165转录组浅析，在37℃下分别有422个上调和611个下调的差别转录基因。除去共同的差别表达基因并在更严谨参数的筛选下，5008分别有122个上调和237个下调的显著差别表达基因，其中氨基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢中具有更多的显著下调基因。在次级代谢中，除了糖基转移酶ValG、转运蛋白ValH和双组份调控蛋白ValPQ外，井冈霉素基因簇中其它基因的转录水平有着4-23倍的显著上调，另外还发现有3个次生代谢合成基因簇的整体转录水平发生显著上调。在初级代谢中，第一，糖酵解中6-磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶基因的转录水平略有下调，同时葡萄糖酸激酶和柠檬酸裂解酶显著上调，这暗示37℃发酵条件下糖酵解和三羧酸循环的代谢速率降低，碳代谢流量发生转变并更多地进入到磷酸戊糖途径。第二，一些关键氮代谢基因，如谷氨酰胺合成酶GlnA和氮代谢调控蛋白GlnR，在37℃是显著下调的，而催化2-酮戊二酸生成谷氨酸的谷氨酸脱氢酶是上调的，这暗示5008在37℃时处在高浓度谷氨酸环境下。进一步利用氨基酸浅析仪发现5008胞内谷氨酸浓度在37℃时仅有30℃的十分之一，而谷氨酰胺的浓度较为接近，这暗示谷氨酸作为氮代谢前体在37℃条件下主要用于合成井冈霉素。在22个显著差别转录的调节基因中，一个SARP家族转录调节基因SHJG0322的转录展现出最高的温度敏感性（128倍）。该基因缺失突变株JG27在30℃条件下井冈霉素产量接近于菌株5008，而在37℃条件下其产量不到5008的20%。转录浅析结果显示valA和valK在37℃分别上调了100倍和26倍，而在JG27中都只上调了6倍。分别利用红霉素抗性基因强启动子和天然启动子制约下的SHJG0322对JG27进行回补，发现回补菌株在37℃条件下产量都上升到5008的80%以上。这表明SHJG0322作为正调节基因参与了井冈霉素合成的温度调控。第三部分基于比较组学的井冈霉素高产机制剖析我们进一步测定了工业菌株TL01的基因组序列，其染色体大小为9.84Mb，比菌株5008小305.76kb。主要差别在于靠近染色体左臂的三个大片段的缺失，大小分别为78.98kb、144.01kb和79.63kb，共编码了234个蛋白，其中有61个转座酶、18个调控蛋白、16个转运蛋白、28个水解酶和56个未知功能蛋白。我们在5008中分别敲除了这三个区域，其产量以4.7克/升分别提升到7.5克/升、7.6克/升和13.9克/升。在同时缺失三个区域的多重突变株中，产量继续提升到14.9克/升，接近工业菌株产量的80%以上。另外，两个基因组中还有着33个InDel和90个SNV位点，除了在井冈霉素结构基因间隔区，还位于78个已知功能基因（编码了18个转录因子、39个初级代谢相关酶和8个转运/膜蛋白等）和24个未知功能基因的内部或上游区域。第一，在工业菌株井冈霉素基因簇中，反向排布的valABC与valKLMN操纵子之间有着137bp缺失；第二，对其中的7个调节基因进行敲除，突变株产量都有不同程度的提升（5.6-13.3g/L），表明发生遗传变异的调节基因降低了对井冈霉素合成的严谨调控作用；第三，初级代谢中关键酶（柠檬酸合成酶、尿黑酸双加氧酶和乙酰/丙酰-CoA羧化酶）发生遗传突变降低了三羧酸循环的代谢速率，使得工业菌株代谢流量发生变化。井冈霉素高产是其产生菌基因组和外界发酵环境相互作用的结果，除了探讨5008在30℃和37℃条件下的转录谱变化，我们还开展了5008和TL01分别在低产普通发酵培养基（YMG）和高产工业培养基（IND）中的转录组浅析。TL01相比5008在YMG和IND条件下分别有942个和1772个差别表达基因（DEGs）。然而相比YMG，5008和TL01在IND条件下的DEGs分别达到5314个和4761个，显示出不同培养基对基因表达的巨大扰动。不考虑培养基变化，TL01相比5008有282个共同的DEGs，其中仅有萜类和环噻唑霉素基因簇的转录显著上调。而在糖异生途径中两个关键酶果糖1,6-二磷酸和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶平均分别上调5.1倍和16.8倍。另外，共同下调的131个DEGs中绝大多数由三个缺失区域与线型质粒编码。有趣的是，相比5008，TL01仅在IND条件下出现染色体区域性的转录谱变化，即在染色体左末端到大片段缺失区域III这一段接近1.9Mb的区域内，只有井冈霉素和PKS-II型的基因簇是转录上调，其余都是转录下调的，线型质粒编码基因显著下调，同时脉冲场电泳发现线型质粒在TL01中有着更低拷贝。不考虑菌株变化，相比YMG培养环境，在IND条件下有3749个共同的DEGs，其中井冈霉素合成基因的转录显著上调，平均提升超过100倍。另外，我们还发现线型质粒和环型质粒基因在IND条件下都是显著上调的。由此，菌株（遗传）变化可选择性地调节基因组的转录，使得一些消耗能量的区域（如线型质粒和一些染色体非必需区域）转录显著下调，同时少量初级代谢基因转录发生显著变化使其代谢流发生转向，有利于井冈霉素的合成。而培养基（环境）转变对菌株影响更大，相应地带来更多能量，除了显著诱导激活井冈霉素合成基因外，还可以保证其内源质粒进行高效复制。第四部分组学浅析基础上的井冈霉素工业菌株的正向工程改造基于以上组学浅析，我们考虑初步以系统的水平改造工业菌株TL01。一方面利用Cre-LoxP的特异性重组系统对在TL01中整体转录下调的大片段区域进行了缺失，突变株产量没有显著提升，但生长较为迅速，积累了更多生物量，表明该菌株代谢更为旺盛。另一方面，通过高温与超低浓度的SDS联用策略将线型质粒进行消除。首先对菌株5008进行线型质粒消除，得到的两个突变株产量都有显著增加，分别提升了48.6%与37.2%。随后，进一步对工业菌株TL01进行线型质粒消除，其产量以18.4克/升提升到突变株的22.2克/升，提升了20%以上。综上所述，本论文通过比较基因组、转录组浅析并结合经典的遗传操作成功揭示了井冈霉素高产的分子机理，在此基础上定向改造现有工业菌株，初步实现了超高产工程菌的构建，为进一步理性改良井冈霉素产生菌与优化其生产工艺奠定了论述基础，同时对通过比较功能基因组学探讨其它抗生素高产机理及其代谢工程改造也具有一定的借鉴作用。关键词：高产论文井冈霉素论文基因组论文转录组论文温度调节论文正向工程论文
摘要5-9
ABSTRACT9-17
第一章 文献与综述17-49
1.1 微生物基因组学17-22
1.1.1 微生物基因组学及其测序技术的进展17-20
1.1.2 微生物基因组特点及其面对的探讨挑战20-22
1.2 微生物药物产生菌的功能基因组学22-41
1.2.1 青霉素及其产生菌的功能基因组学23-29
1.2.2 红霉素及其产生菌的功能基因组学29-32
1.2.3 链霉素及其产生菌的功能基因组学32-34
1.2.4 阿维菌素及其产生菌的功能基因组学34-37
1.2.5 克拉维酸及其产生菌的功能基因组学37-39
1.2.6 我国微生物药物产生菌基因组学的探讨近况39-40
1.2.7 展望40-41
1.3 井冈霉素及其产生菌的探讨进展41-48
1.3.1 井冈霉素及其作用机制41-42
1.3.2 井冈霉素及其产生菌的发现进展历程及其探讨概况42-44
1.3.3 井冈霉素生物合成与发酵工程的探讨进展44-48
1.4 本探讨的内容和作用48-49
1.4.1 探讨内容48
1.4.2 探讨作用48-49
第二章 材料与策略49-70
2.1 菌株与质粒49-51
2.2 培养基与试剂51-53
2.3 实验策略53-57
2.4 缺口填补的计算机策略57
2.5 缺口填补的实验策略57-62
2.6 基因组注释及其生物信息学浅析62-65
2.7 DNA 芯片实验与数据浅析65-70
第三章 吸水链霉菌井冈变种 5008 基因组完整图谱的构建与剖析70-99
3.1 引言70-71
3.2 结果与浅析71-98
3.2.1 5008 大规模 DNA 测序、拼接与基因组完整图谱的构建71-75
3.2.2 5008 全基因组的基本特点75-79
3.2.3 5008 基因组的末端端粒系统79-83
3.2.4 5008 与其它链霉菌全基因组的比较浅析83-89
3.2.5 5008 基因组中次生代谢合成基因簇的功能预测与浅析89-91
3.2.6 前体参与井冈霉素产生的代谢网络重建91-98
3.2.6.1 中心碳代谢提供初级代谢前体合成井冈霉素91-94
3.2.6.2 井冈霉素结构中氮元素的来源94-95
3.2.6.3 复杂多样的转运、水解和调控系统95-98
3.3 小结与讨论98-99
第四章 井冈霉素生物合成温度调控的转录组探讨99-112
4.1 引言99-100
4.2 结果与浅析100-111
4.2.1 芯片设计及其数据质量验证100-102
4.2.2 高温 37℃发酵条件下差别表达基因的筛选与功能浅析102-104
4.2.3 高温 37℃发酵对菌株 5008 次级代谢的影响104-105
4.2.4 高温 37℃发酵对菌株 5008 初级代谢的影响105-108
4.2.5 一个 SARP 家族转录调控基因参与井冈霉素的温度调节108-111
4.3 小结与讨论111-112
第五章 基于比较组学的井冈霉素高产机制剖析112-147
5.1 引言112-113
5.2 结果与浅析113-145
5.2.1 井冈霉素工业菌株 TL01 大规模 DNA 测序、拼接与完整图的构建113-114
5.2.2 比较基因组发现在 TL01 中有着三个大片段缺失和少量遗传突变114-120
5.2.3 三个大片段缺失区域对井冈霉素高产起着关键贡献120-122
5.2.4 少量遗传突变对井冈霉素高产的影响122-131
5.2.4.1 突变位于井冈霉素结构基因的间隔区域122-125
5.2.4.2 突变影响转录因子和全局性调控125-130
5.2.4.3 突变影响菌体初级代谢关键酶的表达与活性130-131
5.2.5 井冈霉素高产的转录组探讨131-145
5.2.5.1 芯片相关的实验设计132-134
5.2.5.2 差别表达基因的筛选与功能分类134-138
5.2.5.3 差别表达基因应答于菌种改良138-141
5.2.5.4 差别表达基因应答于培养基优化141-145
5.3 小结与讨论145-147
第六章 组学浅析基础上的井冈霉素工业菌株的正向工程改造147-156
6.1 引言147-148
6.2 结果与浅析148-154
6.2.1 染色体 1.2Mb 大片段区域的缺失对井冈霉素及其产生菌的影响148-152
6.2.2 线型质粒的消除可提升井冈霉素的产量152-154
6.3 小结与讨论154-156
第七章 总结与展望156-160
7.1 工作总结156-159
7.1.1 5008 基因组剖析及其井冈霉素温度调节的转录组探讨的总结156-158
7.1.2 组学水平的井冈霉素高产的反向与正向工程的总结158-159
7.2 探讨展望159-160
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