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摘要：口腔癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一,近年来口腔癌的发病率呈现显著增高走势、且发病低龄化,已成为威胁人类健康的重要疾病之一。口腔癌的首选治疗策略是外科手术治疗,而化学治疗是口腔癌重要的辅助治疗策略之一。目前化疗所面对的主要不足是肿瘤细胞对化疗药物敏感性的下降,导致多药耐药(Multidrug resistant, MDR)的产生,使肿瘤细胞产生具有同时抵抗具有不同结构和功能作用的广谱化疗药物的能力。目前认为,肿瘤细胞这种多药耐药的形成,与包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在内的膜泵出蛋白的过度表达密切相关。P-gp是源于ATP-结合盒家族(ATP-binding Cassette superfamily,ABC)的种跨膜磷酸糖蛋白,由MDR-1基因编码。P-gp是一种具有ATP酶活性的跨膜泵,其作用底物可以是内源性的物质(如细胞因子、类固醇激素等),也可以是外源性的物质(如化疗药物等)。P-gp具有将大量化合物,尤其是水合阳离子的化合物以细胞内泵至细胞外间隙的功能,以而导致细胞内P-gp作用底物浓度的降低。当抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞时,脂溶性药物通过浓度梯度而进入细胞内,药物在细胞内与P-gp结合后,P-gp通过水解ATP获得能量将细胞内药物泵出细胞外,以而导致细胞内药物的浓度不断下降,使药物对细胞的损害减弱并直至消失,最终产生耐药性。不同组织细胞中P-gp的作用不同,如在肠道主要影响药物的吸收,在肝脏和肾脏则主要影响药物的代谢与排除,在中枢神经系统和循环系统则主要影响药物的分布,其可降低细胞内的药物浓度以而使机体免受药物的损害。在人恶性肿瘤的探讨发现,P-gp的表达水平与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性及肿瘤患者的存活率呈负相关。有探讨认为,不同的个体MDR-1基因是有差别的,但在治疗前MDR-1基因多态性体现并未影响细胞内药物的转运和患者病情的进展。当肿瘤细胞与抗肿瘤药物长期接触后,诱导MDR-1基因扩增并且大量表达P-gp。环氧化酶(Cycloxygenase, COX)是花生四烯酸转化为前列腺素(Prosta-glandin, PG)历程中的限速酶,直接影响PG的合成并参与机体的许多生理和病理历程。目前已发现COX有2个亚型,即COX-1和COX-2。COX-1是一种在许多组织细胞内持续表达的“结构酶”,具有推动生理性前列腺素的合成,调节和维持组织细胞正常生理活动的作用。在保持自身稳定方面,具有重要的生理功能,如调节肾血流量、保护胃黏膜及血小板功能等。COX-2主要有着于中枢神经系统、精囊和肾脏等组织中,而在其他正常组织中检测不到,但当机体有不同的炎症反应和受到促有丝分裂刺激后,则会产生COX-2,催化合成PG而参与炎症反应。各种生长因子、致炎细胞因子、胆汁酸、致癌剂和紫外线光谱照射均可推动COX-2的表达。目前认为,包括口腔癌在内的多种恶性肿瘤的发生、进展与COX-2的过表达有关,其可导致上皮细胞癌变的发生,其影响的方面包括肿瘤发生、细胞外基质的黏附性增强、抗细胞凋亡作用、降低E-cadherin和TGF-p2受体的表达以及增强Bcl-2蛋白的表达等。近年来探讨发现,选择性COX-2抑制剂除可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡外,还能增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等,此外探讨认为COX-2抑制剂可以通过调节ABC-转运家族中的膜转运蛋白活性而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。在本探讨中,我们通过体外实验探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用及对P-gp表达和功能调节的影响,初步探讨选择性COX-2抑制剂增强KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的作用机制。第一章塞来昔布增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用目的：探讨COX-2抑制剂塞来昔布与长春新碱联合运用后能否增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用。策略：收集对数生长期KB和KB/VCR细胞,以2×103个/孔浓度分别接种于96孔板,常规培养24h,细胞贴壁后将含长春新碱的培养基,浓度分别为0.375、0.75、1.5和3μmol/L,及不含长春新碱的培养基(对照组),分别加入接种于96孔板的KB和KB/VCR细胞中,培养24、48和72h后,进行MTT实验计算细胞生长抑制率,比较长春新碱对KB及KB/VCR细胞生长抑制率的差别。MTT法检测不同浓度塞来昔布(10、20、40和80μmol/L)对KB及KB/VCR细胞的生长抑制率。本探讨采取塞来昔布(10μmol/L)、长春新碱(1.5μmol/L)、塞来昔布+长春新碱(10μmol/L+1.5μmol/L)和塞来昔布+长春新碱+前列腺素E2(PGE2)(10μmol/L+1.5μmol/L+100μg/L)作用于KB/VCR细胞,24、48和72h后,MTT法测定各组药物处理对KB/VCR细胞的生长抑制率。用金正钧法计算g值,判断塞来昔布与抗癌药物联合运用后对KB/VCR细胞的杀伤作用,当0.85≤q≤1.15为相加作用,q1.15为协同作用,q0.85为拮抗作用。用Western blot检测KB和KB/VCR细胞P-gp表达的差别。结果：MTT结果显示,不同处理浓度的长春新碱处理KB细胞,细胞的生长抑制率随着长春新碱浓度和作用时间的增加而增大,体现为时间剂量依赖效应(P0.01)；各浓度之间的细胞抑制率也有显著性差别(P均0.01)。不同处理浓度的长春新碱处理KB/VCR细胞,细胞的生长抑制率随着长春新碱浓度和作用时间的增加而增大,体现为时间剂量依赖效应(P0.01)；各浓度之间的细胞抑制率也有显著性差别(P均0.01),但长春新碱在较低浓度时(0.375μmol/L)作用24、48和72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制率差别无统计学作用(F=1.306,P=0.318)。长春新碱在不同浓度及时间点,对KB细胞的生长抑制率显著高于KB/VCR细胞,P均0.01。不同处理浓度的塞来昔布处理KB细胞,细胞的生长抑制率随着塞来昔布浓度和作用时间的增加而增大,体现为时间剂量依赖效应(P0.01)；各浓度之间的细胞抑制率也有显著性差别(P均0.01),但塞来昔布在10μmol/L浓度下作用24、48和72h后,其对KB细胞的生长抑制率差别无统计学作用(F=0.366,P=0.704)。不同处理浓度的塞来昔布处理KB/VCR细胞,细胞的生长抑制率随着塞来昔布浓度和作用时间的增加而增大,体现为时间剂量依赖效应(P0.01)；各浓度之间的细胞抑制率也有显著性差别(P均0.01),同样塞来昔布在10μmol/L浓度下作用24、48和72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制率差别也无统计学作用(F=1.769,P=0.225)。塞来昔布(10μmol/L)联合长春新碱(1.5μmol/L)作用于KB/KBV细胞24、48及72h后,其生长抑制率高于塞来昔布组、长春新碱组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组,差别有统计学作用,P均0.01。塞来昔布与长春新碱联用在24、48、72h时的q值分别为1.160、1.282、1.287,均为协同作用。Western blot结果显示,KB/VCR细胞P-gp的表达显著高于KB细胞,P0.01。结论：小剂量选择性COX-2抑制剂塞来昔布(10μmol/L)与抗癌药物长春新碱联合运用后,可显著强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用,并且塞来昔布与长春新碱对细胞增殖的抑制呈协同作用,其机制可能与诱导细胞凋亡及影响P-gp的表达有关。第二章塞来昔布通过抑制P-gp表达提升KB/VCR细胞对长春新碱敏感性目的：为了探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强长春新碱对KB/VCR细胞生长抑制作用的作用机制。策略：将KB/VCR细胞分为5组,分别长春新碱(1.5μmol/L)组、塞来昔布(10μmol/L)组、长春新碱与塞来昔布联合运用组(1.5μmol/L+10 μmol/L)、长春新碱+塞来昔布+PGE2联合运用组(1.5μmol/L+10μmol/L+100μg/L)及对照组,各组加药处理48h后,用流式细胞术检测塞来昔布对KB/VCR P-gp功能活性的荧光底物Rho123在细胞内的蓄积以检测P-gp的功能。用Western blot法检测各组P-gp的表达。结果：塞来昔布联合长春新碱用药组、塞来昔布组和长春新碱+塞来昔布+PGE2联合用药组KB/VCR细胞P-gp表达显著低于对照组和VCR(1.5μmol/L)组,P均0.01,而长春新碱+塞来昔布+PGE2联合运用组P-gp表达水平则显著高于长春新碱+塞来昔布组。塞来昔布组、塞来昔布联合长春新碱用药组和塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞内Rho123的荧光强度显著高于长春新碱组和对照组,P均0.01。结论：塞来昔布可以通过下调P-糖蛋白的表达增强KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性,外源性PGE2可以减弱塞来昔布的作用效果。总之,本探讨的体外实验探讨结果表明,选择性COX-2抑制剂塞来昔布可以增强长春新碱对KB/VCR细胞的杀伤作用,这种作用可能与下调KB/VCR细胞P-gp的表达与功能有关,为进一步理解COX-2在肿瘤细胞多药耐药性的产生及其COX-2抑制剂增强肿瘤细胞化疗敏感性的机制提供实验依据。关键词：环氧化酶-2论文塞来昔布论文多药耐药论文P-糖蛋白论文口腔癌论文
摘要3-8
ABSTRACT8-13
目录13-14
前言14-17
第一章 塞来昔布联合长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用17-44
1 材料与策略17-25
2 结果25-40
3 讨论40-44
第二章 塞来昔布通过抑制P-gp表达提升KB/VCR细胞对长春新碱敏感性44-60
1 材料与策略44-51
2 结果51-56
3 讨论56-60
全文总结60-61