本站原创
摘要：探讨背景先天性长QT综合征(long QT syndrome, LQTS)属于遗传性心律失常,是由于编码心肌细胞离子通道的基因异常所导致,也被称为“离子通道病”。LQTS患者具有QT间期延长和T波形态异常的心电图特点,临床体现为反复发作的晕厥和室性心律失常,尤其是尖端扭转性室性心动过速(Torsade de pointes, TdP)。据统计,未经治疗的LQTS患者的10年死亡率高达50%,且约1/2500的患者终身伴随猝死风险。美国近年数据显示,LQTS在人群中的发病率约1：2000～1：5000,尤其多见于儿童和青少年。据此推算,我国LQTS患者接近30万。由于LQTS具有发病突然、猝死率高、青少年多发的特点,目前已成为遗传性心律失常的探讨前沿和热点。1991年,Keating等首次将LQTS的致病基因定位于人类11号染色体,迄今已发现至少13个基因与LQTS相关。根据不同基因把LQTS划分为13个亚型：KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)、SCN5A (LQT3)、ANK2(LQT4)、 KCNE1(LQT5)、KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1C (LQT8)、 C3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AP9(LQT11)、SCNA1(LQT12)和KCNJ5(LQT13)。这些致病基因通过错义突变、缺失/插入突变、移码突变和剪接突变等多种方式造成心肌离子通道功能异常。全世界已发现LQTS致病基因上的900多个突变位点。然而探讨发现,不同种族的突变位点有着差别,例如LQT1-LQT3基因型的非同义突变在白种人中约4%,而其他人种约6～8%。也就是说,LQTS患者的致病基因基本相同,而突变位点不尽相同。由此,基因筛查尤为必要。随着分子遗传学的进展,欧美已逐渐将基因检测作为明确LQTS诊断的一种临床手段。2011年,美国心律学会和欧洲心律学会联合发表了《心脏离子通道病与心肌病基因检测的专家共识》,该共识对LQTS最常见的3种致病基因(KCNQ1、KCNH2和SCN5A)筛查做了重点推荐,其中,临床诊断明确以及高度可疑的LQTS患者均被倡议进行上面陈述的基因检测。近几年,我国探讨者共发现约50个与国人LQTS相关的突变位点。由于基因检测昂贵,目前我国针对LQTS的基因检测多用于科研,临床远未普及。LQTS的临床诊断主要基于患者静息心电图的QTc数值、晕厥病史及心源性猝死家族史。然而,约10～40%的患者和致病基因携带者的静息QTc值正常。由此,对临床高度可疑的患者筛查特定基因十分重要。有报道称,有显著LQTS临床体现的患者,其致病突变的检出率约75%。Tester等探讨发现,LQTS的特定基因型和体现型密切相关,尤其是LQT1～LQT3型患者,其心电图T波形态和发病诱因都具有显著特点。如LQT1型患者的典型T波体现为基底部宽大且上升支和下降支光滑；LQT2的T波特点是低平或状；LQT3则以延迟出现的高尖双相T波为特有体现。在发病诱因方面,LQT1型患者多在运动、游泳等交感神经兴奋时发生晕厥或猝死,LQT2和LQT3型患者则于休息或睡眠时多发心血管事件。值得关注的是,听觉刺激是LQT2的特定触发因素。特异的临床体现不仅有利于进行靶基因检测,以而明确基因型,而且有助于制定个体化治疗案例。由于LQTS各基因型的发病机制不同,患者对药物的敏感程度并不相同。作为首选用药,β受体阻滞剂能显著减少LQT1患者的晕厥次数；LQT2患者服药后的晕厥复发率仍较高；而对于钠通道基因突变导致的LQT3型,β受体阻滞剂往往效果较差,应首选ICD治疗。由此可见,基于临床特点的基因筛查能提升诊断率以及更有效地指导治疗。LQTS包括两种遗传方式,分别是常染色体显性遗传的Romano-Ward综合征(RWS)和常染色体隐性遗传的Jervell andLange-Nilsen综合征(JLNS)。RWS最常见的致病基因为KCNQ1和KCNH2, KCNQ1和KCNE1是JLNS的致病基因。根据指南推荐,首先筛查出LQTS先证者的突变基因,再对家系成员进行相同位点的基因检测。不携带先证者的致病突变是家系成员排除LQTS的唯一策略。本探讨中,我们收集了3例LQTS先证者及其家系成员的临床资料并进行浅析,力图明确LQTS的常见基因型和体现型的关联性。同时,在根据T波形态预测基因型后,我们筛查了各先证者的相关基因；待发现突变,再检测该家系成员的相同位点,以期发现国人LQTS相关的基因突变。探讨目的1、本探讨收集了3例LQTS先证者及其家系成员共22人的临床资料,通过浅析探讨对象的病史、发病诱因、静息心电图QTc值及T波特异形态,力图明确LQT1型和LQT2型患者基因型和体现型的联系。2、本探讨筛查了1例JLNS先证者的KCNQ1和KCNE1基因；筛查了2例RWS先证者的KCNQ1和KCNH2基因,待检测出突变位点后,再对其家系成员进行相同位点的基因检测,以期发现LQTS的基因突变位点。探讨对象依据Schwartz等提出的先天性长QT综合征诊断评分标准：≥4分诊断为LQTS患者,且为入选标准。对2007年3月至2011年3月在南方医科大学附属南方医院心内科的住院患者进行筛查,共确诊3例LQTS先证者,男1例,女2例,均为汉族,来自广东省。结合2011年HRS/EHRA发表的共识中关于LQTS基因筛查的推荐,对先证者及家系成员(包括先证者的同代、子女及父母)共22人进行了临床资料收集。100名来自体检中心的健康成人参与了本探讨。上面陈述的探讨对象均已知情同意。所有探讨对象均已排除血管迷走性晕厥、直立性低血压、致心律失常性右室心肌病、儿茶酚胺型室性心动过速以及获得性长QT综合征的各种病因,包括：1、药物引起的QT间期延长：抗心律失常药物、抗生素、抗精神病药物、化疗药物等；2、电解质紊乱及全身系统疾病：低钾血症、低钙血症,糖尿病、结缔组织病,肾功能衰竭、嗜铬细胞瘤等；3、器质性心脏病：冠心病、心肌肥厚、心力衰竭、心肌病、二尖瓣脱垂等。探讨策略1、收集并浅析先证者及家系成员的临床资料,记录安静状态下12导联同步心电图。采取Schwartz评分系统诊断LQTS,并根据Zhang等提出的特异T波形态预测患者基因型。必要时行24h动态心电图或运动试验明确诊断。临床资料包括患者是否出现晕厥和首次发作时间、晕厥的诱发因素(运动、情绪激动或安静、睡眠等)、是否有心源性猝死家族史及既往诊治情况等。抽取所有探讨对象外周血5ml, EDTA法抗凝,置于-80℃冰箱保存备用。2、采取常规苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测提取产物并置于-20℃保存。参照Splawski和Syrris等的相关探讨设计KCNQ1基因的17对引物、KCNE1基因的3对引物和KCNH2基因的19对引物,交由上海英潍捷基生物公司合成。采取聚合酶链反应(PCR)扩增三个基因的全部外显子。PCR反应系统如下：采取Platinum(?) Taq反应系统共25uL,除了1uL模板DNA,其余24uL的Supermix组成为：10xPCR缓冲液2.5uL2.5mM dNTP混合液2uL,50mM MgCl2O.75uL,5uM上游及下游引物各1uL,Platinum(?) Taq DNA聚合酶0.2uL,其余加入灭菌蒸馏水补足体积。上面陈述的反应系统的扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s及72℃延伸90s,经过35个循环后,再以72℃5min延伸,终末以4℃保存。PCR完成后采取1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,对于电泳结果不满意的,重新优化反应系统和反应条件,直至最佳效果。最后由上海英潍捷基生物公司采取3730XL型DNA测序仪对扩增产物直接测序。测序结果运用Chromas软件进行BLAST同源比较,如有碱基转变,则在NCBI的SNP数据库中查找,确定是否为已公布的变异位点,明确是否有着氨基酸序列转变。扩增家系成员该变异位点的相应外显子并进行基因检测浅析。同时筛查100名正常对照成员。结果1、Schwartz评分≥4分者3例,诊断为LQTS。其中男1例,女2例,年龄23～46岁,首次发病年龄15～46岁,QTc值486-582ms。评分为2-4分者2例,为临床可疑病例。余家系成员评分均≤1。家系成员B2,评分为1,经基因检测诊断为致病基因携带者。探讨对象中5例有晕厥史,其中4例在情绪刺激、运动或劳累时诱发,1例于夜间休息、睡眠中发作。1例有猝死家族史,随访历程中探讨对象均未发生猝死。T波形态预测基因型：LQT1型2例,LQT2型2例,未发现其它基因型。1例家系成员的的心电图特点不显著,无法预测。家系A先证者及其子均伴先天性耳聋,属于JLNS；B和C为RWS家系。先证者A1和C1服用β受体阻断剂有效,B1效果差。2、DNA测序结果显示先证者B1及哥哥B2有着KCNQ1基因突变,该突变位点在第6号外显子上,体现为第830个核苷酸C(胞嘧啶)突变为T(胸腺嘧啶),导致编码Iks的α亚单位第277位子由丝氨酸(TCG)突变为亮氨酸(TTG)。此错义突变S277L位于KCNQ1的跨膜片段上。该家系其余成员及100名正常对照者均未发现该突变,NCBI基因库也无此位点的SNP数据。该突变在中国LQTS患者中曾被发现。结论1、中国LQTS患者特定基因型(LQT1型和LQT2型)与体现型有着关联,与国外报道基本一致。2、.在中国一LQTS家系中发现了KCNQ1基因6号外显子的突变位点C830T,导致氨基酸错义突变为S277L,此杂合突变可能是RWS的致病突变。关键词：长QT综合征论文基因突变论文KCNQ1论文KCNH2论文DNA测序论文
摘要3-8
ABSTRACT8-16
前言16-20
材料与策略20-31
1、实验材料及试剂配制20-21
2、主要实验仪器21-22
3、分子生物学运用软件22
4、DNA样本22
5、探讨对象22-25
6、实验策略步骤25-31
结果31-36
1、家系资料及图谱31-34
2、PCR产物琼脂糖电泳结果34
3、测序结果及突变比较浅析34-36
讨论36-45
结论45-46
不足之处46-47
展望47-48