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摘要：目的：建立成骨细胞和血管内皮细胞共培养系统，通过体外神经肽CGRP对共培养系统细胞的干预，探讨CGRP对细胞交互作用的调控作用，证明CGRP在颌骨骨创伤修复历程中，对骨痂形成及成骨的影响作用。策略：实验第一部分，将MG63与EC以2:1比例，按5.0x104个/孔的浓度接种于六孔培养板中，每板孔1至孔4利用的培养液中分别含有10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)、10~(-10)mol/LCGRP，孔5为MG63与EC单纯共培养培养基中不添加CGRP，孔6单独培养MG63并且不添加CGRP。共培养一周及两周后显微镜下观察共培养系统生长情况并进行茜素红染色观察观察钙化结节；实验第二部分,对EC进行DiI染色（DiI浓度为10-10mol/L，染色时间10分钟），将MG63与EC以2:1比例，按2.0x104个/ml的细胞浓度接种于盖玻片上，分别放置于6孔板中培养，分为6组，培养液中分别含10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)、10~(-1)0mol/LCGRP及不含CGRP的对照组还有MG63单独培养的对照组，于培养第三天进行collagenΙ免疫荧光染色，采取DAPI衬染细胞核，荧光显微镜记录结果；实验第三部分，将MG63以2.0x104个/孔接种于96孔板，采取对应浓度CGRP培养的EC一天后的培养液培养，分为6组，1-4组培养液中分别含有10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)、10~(-10)mol/LCGRP，第5组不含CGRP，最后第6组为不含细胞的对照组，于培养的第3天用MTT法测定5组成骨细胞的数量，之后重复实验两次，用Spss16.0软件将所得数据进行统计学浅析并绘制不同浓度CGRP作用下细胞增殖曲线；实验第四部分，MG63以1.0x10~5个/孔接种于6孔板，采取对应浓度CGRP培养的EC一天后的培养液培养，分为6组，1-4组培养液中分别含有10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)、10~(-10)mol/LCGRP，第5组不含CGRP，最后第6组为普通培养液培养，于共培养一周后进行蛋白浓度测定并进行ALP活力测定；重复该实验两次，将实验所得数据用Spss16.0软件进行统计学浅析并绘制不同浓度CGRP作用下成骨细胞ALP活性曲线；实验第五部分，采取transwell分离培养EC及MG63，EC以2.0x10~4个接种于transwell小室中，MG63以4.0x10~4个/孔接种于小室下方培养板中，分为6组所用培养液分别为含有10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)、10~(-10)mol/LCGRP及单纯培养EC和MG63以及MG63单独培养组。于共培养一周后采取人Ι型胶原蛋白酶联免疫试剂盒测定各组collagenΙ。结果：CGRP对于成骨细胞增殖具有推动作用，10-7与10-10组比较有统计学差别(P0.05)，10-10组与对照组比较有统计学差别(P0.05)。以检测中用的各个浓度来看10-10l/LCGRP刺激成骨细胞增殖较显著，可见CGRP对于成骨细胞增殖作用在共培养系统中具有剂量相关性。共培养系统中相对于单独成骨细胞培养的成骨钙化更早，推动成骨钙化作用显著，由此可见血管内皮细胞在成骨分化成熟中发挥推动作用。钙结节的形成与加入CGRP浓度体现出相反的走势。添加10-7、10-8、10-9、10-10mol/LCGRP各组的ALP活力相对于普通单独培养MG63的对照组体现为显著抑制，其中10-7mol/LCGRP组抑制作用最为显著，采取10-7mol/LCGRP培养组与其他各组比较均有统计学差别(P0.05)。比较共培养组与单独培养成骨细胞组可见成骨细胞单独培养组的P酶活力更高。10-9、10-10mol/LCGRP组形成相对于对照组体现出对于collagenΙ的生成具有较显著的推动作用，其余组的作用不显著。结论：高浓度CGRP对于钙化在共培养系统中可能有着抑制作用，高浓度的CGRP对于P活力体现出抑制作用。CGRP在低浓度时推动成骨基质中有机质collagenΙ的形成，低浓度CGRP对于共培养系统中成骨细胞同样具有刺进其增殖的作用。关键词：成骨细胞论文血管内皮细胞论文CGRP论文共培养论文细胞增殖分化论文ALP活力论文
摘要5-8
Abstract8-12
前言12-15
材料与策略15-19
实验部分一：CGRP对于共培养系统中成骨细胞增殖影响的探讨19-22
实验部分二：CGRP对于共培养系统中成骨细胞分化影响的探讨22-33
讨论33-42
结论42-43