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家兔家兔MITF基因同源性、多态性与不同时期表达水平技巧

收藏本文 2024-04-21 点赞:8278 浏览:25918 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:本试验克隆了家兔MITF基因第2、4、5、7外显子序列,并将其进行了与人、马、牛、大鼠、鸡等几个物种的序列同源性比较。结果发现这些外显子片段在不同的哺乳动物中都具有很高的同源性,均在90%以上,而与禽类的同源性较低,只有84%以上,说明该基因在物种进化历程中相比较较保守。本试验采取PCR-SSCP技术,以白色獭兔、海狸色獭兔、九疑山兔、比利时兔和闽西南黑兔群体为试验对象,设计引物检测家兔MITF基因中包含五个外显子的相关基因序列多态性,结果发现,引物1、2、5、7对应的扩增片段均未体现出多态,在利用引物4获得大小为255bp的扩增片段中发现一个SNP (3T)位点,在各群体中体现为3种基因型AA、BB、AB。测序结果显示引物4扩增片段的碱基转换位于5’端的内含子区域,未证实会影响MITF基因编码的氨基酸序列。统计结果表明,白色獭兔群体和九疑山兔群体不处在哈代温伯格平衡状态(P0.05),其余群体则均处于平衡状态。闽西南黑兔群体和比利时兔群体体现出中度多态(0.5PIC0.25),其余群体为低度多态。在家兔MITF基因表达规律的探讨中,以福建黄兔和新西兰白兔的杂交后代群体为探讨对象,分别采集生长发育阶段中第4、6、8、10、12周龄的背部皮肤样品,通过实时荧光定量PCR技术,测定各个时期的MITF基因的mRNA相对表达量,浅析MITF基因在家兔这一生长发育阶段中的mRNA表达规律。结果表明,以4周龄开始,公、母兔的mRNA表达量都出现迅速增加,在6周龄达到一个峰值,随后开始下降,反映出这一段时期内,随着进入显著的换毛期,该基因也处于活跃状态。8周龄后,公、母兔开始体现不同的变化走势,母兔进入第二个波动期,而公兔则平稳增加,结合性别间的生理变化理由,可能是由于雌激素水平的不同,引起变化走势的差别。不同周龄的表达量变化走势反映MITF基因在被毛的更换历程中,可能会受到毛囊生长周期及雌激素水平的影响,在一定程度上参与毛色的形成和变化的调节,是影响毛色的一个重要基因。此外,在浅析正常色与黑斑皮肤的表达量差别的试验中发现,黑斑皮肤中MITF基因的表达量显著高于正常色皮肤,也验证了黑色素的形成和积累可能与MITF基因的表达有关,进而影响皮肤和被毛的颜色。关键词:家兔论文毛色论文小眼畸形相关转录因子(MITF)论文多态性论文PCR-SSCP论文荧光定量PCR论文

    摘要3-5

    Abstract5-10

    常用词语缩写10-12

    第一章 前言综述12-26

    1.1 影响哺乳动物毛色的基因12-19

    1.1.1 黑色素皮质素受体1基因(MC1R)14

    1.1.2 鼠灰色基因(Agouti)14-15

    1.1.3 酪氨酸酶基因(TYR)15-16

    1.1.4 酪氨酸酶相关蛋白基因(TYRP1、TYRP2)16-17

    1.1.5 银灰色基因(Silv)17

    1.1.6 Kit基因17

    1.1.7 小眼畸形相关转录因子基因(MITF)17-19

    1.2 PCR-SSCP技术19-21

    1.3 荧光定量PCR技术21-24

    1.3.1 荧光标记策略21-22

    1.3.2 荧光定量策略的选择22-23

    1.3.3 内参基因的选择23

    1.3.4 荧光定量试验的优化23-24

    1.4 探讨目的及作用24-26

    第二章 MITF基因部分CDS序列同源性比对26-35

    2.1 材料与策略26-29

    2.1.1 试验样本26

    2.1.2 主要试剂26

    2.1.3 主要溶液26-27

    2.1.4 主要仪器27

    2.1.5 家兔基因组DNA提取27-28

    2.1.6 引物设计28

    2.1.7 PCR扩增系统28

    2.1.8 PCR产物回收28-29

    2.1.9 克隆测序与结果处理29

    2.2 结果浅析29-32

    2.2.1 PCR扩增结果29-30

    2.2.2 序列比对浅析30-32

    2.3 讨论32-35

    第三章 MITF基因多态性浅析35-42

    3.1 材料与策略35-37

    3.1.1 试验动物35

    3.1.2 主要试剂与仪器35

    3.1.3 主要溶液35-36

    3.1.4 主要仪器36

    3.1.5 家兔基因组DNA提取36

    3.1.6 引物设计36

    3.1.7 PCR扩增系统36

    3.1.8 PCR-SSCP检测36

    3.1.9 测序36

    3.1.10 数据处理36-37

    3.2 结果与浅析37-40

    3.2.1 引物PCR扩增产物检测37-38

    3.2.2 PCR-SSCP结果38-39

    3.2.3 PCR-SSCP测序结果39

    3.2.4 不同家兔群体引物4扩增片段突变位点的遗传特性39-40

    3.3 讨论40-42

    第四章 MITF基因不同发育阶段表达规律的浅析42-55

    4.1 材料与策略42-46

    4.1.1 试验兔42

    4.1.2 主要试剂和溶液配制42-43

    4.1.3 仪器设备43

    4.1.4 RNA的提取43

    4.1.5 RNA质量和浓度测定43

    4.1.6 RNA反转录系统43-44

    4.1.7 荧光定量引物设计44

    4.1.8 实时荧光定量PCR44-45

    4.1.9 数据处理与统计浅析45-46

    4.2 结果与浅析46-52

    4.2.1 总RNA的纯度检测46

    4.2.2 引物特异性检测46-47

    4.2.3 溶解曲线47-48

    4.2.4 扩增曲线48-49

    4.2.5 MITF基因的表达规律49-52

    4.3 讨论52-55

    第五章 结论55-56

    5.1 主要结论55

    5.2 进一步的工作55-56

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