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摘 要：目的：对原有乳鼠大鼠皮层神经元的原代培养方法进行改进，获得高质量且体外存活时间更长的神经元，以期应用于对细胞功能状态要求高的相关研究。方法：多聚赖氨酸预处理培养皿，分离出生24 h之内的SD大鼠大脑皮层神经元，采用机械吹打与胰蛋白酶化学消化相结合的方法制备单细胞悬液，经计数后以1×105 / mL的细胞密度接种。24 h后加阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养3 d后将培养液全量换为添加B27的培养液。用倒置相差显微镜观察细胞形态，并用膜片钳单通道记录法记录BKCa通道电流。结果：对原有培养方法改进后获得可长期存活的形态典型神经元。在培养36 d时，用膜片钳单通道记录法仍能记录到正常的BKCa通道电流。结论：该培养方法简单，经济，结果稳定，可作为体外原代培养乳鼠神经元的良好实验模型。
关键词：原代培养；皮层神经元；乳鼠；膜片钳；BKCa通道电流
1007-3612（2012）10-0042-05
A Modified Method for Primary Culture of Newborn Rat Cortical Neurons and Its Basic Electrophysiological Property
ZHAO Li， CHEN Yao， GONG Lijing， LU Yuanyuan
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective：To modify previous method of primary newborn rat cortical neuron culture to get purer and more longlasting cells for some related studies. Methods：The cerebral cortic
Key words：primary culture， cortical neurons， newborn rat， patch clamp， BKca current
原代培养神经细胞的生长发育特征与在体神经元非常相似，且具有样本均一性高，实验条件可控、相对恒定，影响因素单一，可有效排除诸多复杂因素（如体内循环、体液、内分泌、血脑屏障）等优点，日益成为神经科学研究中必不可少的实验材料及模型工具[1，2]。然而神经细胞培养与其他类型的细胞培养不同，正常神经细胞只能增大而不能增殖，即只能原代培养，不能传代，没有细胞分裂现象，随着培养时间的延长，神经细胞数只会减少，不可能增加。目前一般认为培养2～4周进行实验比较适宜，4周后细胞就开始退化[3]。而作为研究细胞电生理特性的膜片钳技术既要保证细胞形态特征的完好，又要保存其生理学特征，才能供研究使用[4]。本研究结合相关文献，对原有的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法进行改进，并采用膜片钳内面向外模式记录大电导钙激活钾通道（BKca）单通道电流，旨在建立一种简单、经济、体外存活时间较长且电生理特性正常的大鼠皮层神经元原代培养方法。
1.2 试剂与溶液 EGTA，HEPES，L 多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶为Sigma公司产品；B-27 Supplement为Gibco公司产品；高糖DMEM，青霉素，链霉素为Hyclone公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；其他药品均为国产分析纯。
解剖液（mM）：10 HEPES， 135 NaCl， 5 KCl， 1.3 Na2HPO4.12H2O， 0.2 KH2PO4， 8.8 glucose，105 sucrose， 调节pH 至7.3，0.22 μm孔径滤膜过滤。DMEM完全培养液：89%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。DMEM/B27完全培养液：87%高糖DMEM，10%胎牛血清，2% B-27 Supplement，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL） ），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。电极内液（mM）：100 KCl，2 CaCl2，10 HEPES，用NaOH调 节pH至7.2-7.4，充灌前经0.22 μm滤膜进行过滤。细胞外液（mM）：40 KCl，0.55 CaCl2，1 EGTA，10 HEPES和10 glucose，用KOH调 节pH至7.2～7.4。使用前经0.22 μm滤膜进行过滤。
1.3 培养皿的预处理 包被L多聚赖氨酸： 培养神经元采用直径为35 mm的一次性塑料培养皿（NUNC），在培养前用终浓度为50 Lg/ mL的L多聚赖氨酸包被培养皿，置于超净工作台内（打开皿盖），紫外灯下照射2 h，回收多余液体。干燥后用DMEM冲洗两遍备用。
1.4 培养方法 取出生后24 h的SD大鼠，用去离子水冲洗体表后，于75%医用酒精中消毒，3～5 s后取出，移入超净工作台，在无菌环境下迅速取大脑，置于预冷的解剖液中。分离得到双侧皮层，用眼科镊剔除脑膜及血管，剪碎后转移到离心管内，并加入10倍体积的消化液（消化液为0.25%胰蛋白酶及解剖液（1∶1）的混合液），37℃水浴。采用二次消化的方法：每隔5 min轻晃离心管，使组织块与胰蛋白酶充分接触，10 min后用口径适宜且管口光滑的吸管轻轻吹打十几次，静置，取上清液于另一离心管，用含血清的DMED完全培养液终止消化，经200目尼龙滤网过滤获得单细胞悬液。剩余组织块加入适量消化液重复上述步骤。单细胞悬液 1 000 转/min 离心10 min，倒去上清液后，加DMEM完全培养液重悬，台酚蓝染色计数后，以1×105 的细胞密度接种于培养皿中，每皿2 mL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后加一次阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养基改进组在培养3 d后全量换为DMEM/B27完全培养液，之后每隔3 d半量换液；传统培养基组每隔3 d半量换DMEM完全培养液。倒置相差显微镜（IX71-F22PH，Olympus，Japan）定期观察培养过程中细胞的生长情况。传统培养基组的神经元在培养至6 d时进行单通道BKCa通道电流的记录。培养基改进组培养至36 d时进行单通道BKCa通道电流记录。
1.5 大鼠大脑皮质神经元的形态学观察 细胞接种后定期在倒置相差显微镜下观察神经元生长的情况，并应用MAP2和Cy3免疫荧光双标染色，鉴定本方法培养的神经元。
1.6 BKCa通道电流的记录 实验在室温（20～25℃）下进行，将培养皿置于倒置相差显微镜载物台中。记录所用电极为薄壁硼硅玻璃电极毛细微管 （B15014F，ID：1.05 mm，OD：1.50 mm；Vital Sense Scientific Instruments，Wuhan），用电极拉制仪（PC10，Narishige，Tokyo）
1.7 数据处理与分析 单通道数据经Clampfit10.2分析程序自动测量通道平均电流幅度（Am）、开放概率（Po）、平均开放时间（To）和 平均关闭时间（Tc）。经统计软件对数据及曲线拟合等做统计处理。
数据以均数±标准差表示。统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性为P<0.05，非常显著性为P<0.01。
一般体外培养的神经元存活约4周，在约3周时可观察到神经元退化，出现胞体颗粒增多，立体感下降，光晕减弱，神经纤维退化等变化。与之前报道体外培养神经元生存时间相比，本实验应用改良的培养基培养神经元至36 d时，对其进行电生理特征测试，记录到BKCa通道电流，其通道特性如大电导，电压敏感性，钙敏感性，TEA对通道的特异性阻断以及通道动力学等均符合BKCa的基本特征[4，9，10]，并与培养6 d的神经元BKCa通道电流特性相比无变异。表明在此培养条件下原代培养可存活至5周以上，且细胞状态良好。
参考文献：
司徒镇强，吴军正.细胞培养[M] .北京：世界图书出版公司，2007：119-122.
鄂征.组织培养技术及其在医学研究中的应用[M] .北京：中国协和医科大学出版社，2004：65-69.
[3] Robert F， Cloix JF， Hevor T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture[J].Neuroscience， 2012 Jan 3；200：248-60. Epub 2011 Oct 18.
[4] 杨宝峰.离子通道药理学[M] .北京：人民卫生出版社，2005：274-281.
[5] Ghatta S， Nimmagadda D， Xu X， O’rourke ST， Large conductance， calciumactivated potassium channels： structural and functional implications[J]. Pharmacol Ther，110： 103-116.
[6] Ballarin C， Peruffo A. Primary cultures of astrocytes from fetal bovine brain[J]. Methods Mol Biol， 2012；814：117-26.
[7] Meberg PJ， MillerMW. Culturing Hippocampal and Cortical Neural cells[J]. Methods Cells Biol，2003；71（2）：111-127.
[8] Pacifici M， Peruzzi F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells： a quick protocol[J]. J Vis Exp， 2012 May 24
关键词：原代培养；皮层神经元；乳鼠；膜片钳；BKCa通道电流
1007-3612（2012）10-0042-05
A Modified Method for Primary Culture of Newborn Rat Cortical Neurons and Its Basic Electrophysiological Property
ZHAO Li， CHEN Yao， GONG Lijing， LU Yuanyuan
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective：To modify previous method of primary newborn rat cortical neuron culture to get purer and more longlasting cells for some related studies. Methods：The cerebral cortic
摘自：毕业论文摘要www.udooo.com
es were aseptically removed from 024 hold SD rats and dissected out. Mechanical dissociation and trypsin digestion were combined to conduct monocell suspending media. The dissociated momocortical cells were diluted to 1×105/ml then to be plated on poly Llysinecoated petri dish. After 24h culture， 3μg/mL cytosine arabinoside （AraC） was added to the culture for 24 h to inhibit the outgrowth of glial cells. After three days postplanted， all media were removed from cultures and replaced with medium supplemented with B27. Then half of the culture medium was changed every three days. The morphological changes of neuron cells were observed by light microscope. Immunostaining of microtubuleassociated protein 2 （MAP2） was applied to assess the culture purity. Single channel current was recorded to evaluate the neurons properties by using patch clamp technique. Results： The improved method could increase the cells lifetime. On the 36th day， the primary culture was characterized by normal morphology and was gained typical BKca current. Conclusion：This is a simple and reliable technique for the in vitro primary culture of rat cortical neurons which he longtime livability and normal electrophysiological property.Key words：primary culture， cortical neurons， newborn rat， patch clamp， BKca current
原代培养神经细胞的生长发育特征与在体神经元非常相似，且具有样本均一性高，实验条件可控、相对恒定，影响因素单一，可有效排除诸多复杂因素（如体内循环、体液、内分泌、血脑屏障）等优点，日益成为神经科学研究中必不可少的实验材料及模型工具[1，2]。然而神经细胞培养与其他类型的细胞培养不同，正常神经细胞只能增大而不能增殖，即只能原代培养，不能传代，没有细胞分裂现象，随着培养时间的延长，神经细胞数只会减少，不可能增加。目前一般认为培养2～4周进行实验比较适宜，4周后细胞就开始退化[3]。而作为研究细胞电生理特性的膜片钳技术既要保证细胞形态特征的完好，又要保存其生理学特征，才能供研究使用[4]。本研究结合相关文献，对原有的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法进行改进，并采用膜片钳内面向外模式记录大电导钙激活钾通道（BKca）单通道电流，旨在建立一种简单、经济、体外存活时间较长且电生理特性正常的大鼠皮层神经元原代培养方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新生（< 24 h） SD大鼠，SPF级，由军事医学科学院动物中心提供。1.2 试剂与溶液 EGTA，HEPES，L 多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶为Sigma公司产品；B-27 Supplement为Gibco公司产品；高糖DMEM，青霉素，链霉素为Hyclone公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；其他药品均为国产分析纯。
解剖液（mM）：10 HEPES， 135 NaCl， 5 KCl， 1.3 Na2HPO4.12H2O， 0.2 KH2PO4， 8.8 glucose，105 sucrose， 调节pH 至7.3，0.22 μm孔径滤膜过滤。DMEM完全培养液：89%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。DMEM/B27完全培养液：87%高糖DMEM，10%胎牛血清，2% B-27 Supplement，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL） ），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。电极内液（mM）：100 KCl，2 CaCl2，10 HEPES，用NaOH调 节pH至7.2-7.4，充灌前经0.22 μm滤膜进行过滤。细胞外液（mM）：40 KCl，0.55 CaCl2，1 EGTA，10 HEPES和10 glucose，用KOH调 节pH至7.2～7.4。使用前经0.22 μm滤膜进行过滤。
1.3 培养皿的预处理 包被L多聚赖氨酸： 培养神经元采用直径为35 mm的一次性塑料培养皿（NUNC），在培养前用终浓度为50 Lg/ mL的L多聚赖氨酸包被培养皿，置于超净工作台内（打开皿盖），紫外灯下照射2 h，回收多余液体。干燥后用DMEM冲洗两遍备用。
1.4 培养方法 取出生后24 h的SD大鼠，用去离子水冲洗体表后，于75%医用酒精中消毒，3～5 s后取出，移入超净工作台，在无菌环境下迅速取大脑，置于预冷的解剖液中。分离得到双侧皮层，用眼科镊剔除脑膜及血管，剪碎后转移到离心管内，并加入10倍体积的消化液（消化液为0.25%胰蛋白酶及解剖液（1∶1）的混合液），37℃水浴。采用二次消化的方法：每隔5 min轻晃离心管，使组织块与胰蛋白酶充分接触，10 min后用口径适宜且管口光滑的吸管轻轻吹打十几次，静置，取上清液于另一离心管，用含血清的DMED完全培养液终止消化，经200目尼龙滤网过滤获得单细胞悬液。剩余组织块加入适量消化液重复上述步骤。单细胞悬液 1 000 转/min 离心10 min，倒去上清液后，加DMEM完全培养液重悬，台酚蓝染色计数后，以1×105 的细胞密度接种于培养皿中，每皿2 mL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后加一次阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养基改进组在培养3 d后全量换为DMEM/B27完全培养液，之后每隔3 d半量换液；传统培养基组每隔3 d半量换DMEM完全培养液。倒置相差显微镜（IX71-F22PH，Olympus，Japan）定期观察培养过程中细胞的生长情况。传统培养基组的神经元在培养至6 d时进行单通道BKCa通道电流的记录。培养基改进组培养至36 d时进行单通道BKCa通道电流记录。
1.5 大鼠大脑皮质神经元的形态学观察 细胞接种后定期在倒置相差显微镜下观察神经元生长的情况，并应用MAP2和Cy3免疫荧光双标染色，鉴定本方法培养的神经元。
1.6 BKCa通道电流的记录 实验在室温（20～25℃）下进行，将培养皿置于倒置相差显微镜载物台中。记录所用电极为薄壁硼硅玻璃电极毛细微管 （B15014F，ID：1.05 mm，OD：1.50 mm；Vital Sense Scientific Instruments，Wuhan），用电极拉制仪（PC10，Narishige，Tokyo）
摘自：本科毕业论文www.udooo.com
两步拉制，经抛光仪 （MF-830，Narishige，Tokyo）抛光，电极尖端直径约为1.5 μm。实验采用膜片钳内面向外模式进行单通道记录，细胞内外液采用对称性高K+（140 mM）方式。玻璃微电极充灌电极内液后电阻为4～8 MΩ，给予电极一定正压，用微操纵器控制电极入液。当电极尖端接触细胞表面时，缓慢给与负压，即可见应答电流下降直至为零，表明高阻封接形成。待封接稳定，阻抗达10 GΩ以上，将电极提出液面，在空气中暴露数秒，再入液，即形成内面向外记录膜片。电流信号经膜片钳放大器 [Multiclamp 700B，Axon（（MDC）] 放大，1～2 kHz低通滤波，经模数/数模转换器[Digidata-1440A，Axon（MDC）] ，由pClamp10记录、储存于计算机。采样模式为Gap free，采样频率为2 kHz，8-极Bessel滤波1～3 kHz。1.7 数据处理与分析 单通道数据经Clampfit10.2分析程序自动测量通道平均电流幅度（Am）、开放概率（Po）、平均开放时间（To）和 平均关闭时间（Tc）。经统计软件对数据及曲线拟合等做统计处理。
数据以均数±标准差表示。统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性为P<0.05，非常显著性为P<0.01。
2 结 果
2.1 神经细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察：接种后24 h，细胞已贴壁，胞体较小，呈圆形或椭圆形，折光性良好，分布均匀，有1～2个突起，但细胞间连接较少。经MAP2和Cy3免疫荧光双标染色呈强阳性，荧光显微镜观察本方法培养的神经元纯度高达95%（图1）。摘自：写毕业论文经典网站www.udooo.com
大电导钙激活钾通道（BKCa）是钙激活钾通道家族的一个重要成员，广泛分布于中枢神经系统。其门控机制表现为对胞内钙浓度的敏感性和对膜电位的依赖性，即BKCa通道在膜去极化或胞内Ca2+升高时激活，引发外向钾电流，产生后超极化电位（after hyperpolarization potential， AHP），降低膜兴奋性，从而减少神经元电活动，对神经递质释放和神经网络功能具有重要的调节作用[9，10]。大量研究表明，BKCa通道的功能状态与细胞状态密切相关[11]。一般体外培养的神经元存活约4周，在约3周时可观察到神经元退化，出现胞体颗粒增多，立体感下降，光晕减弱，神经纤维退化等变化。与之前报道体外培养神经元生存时间相比，本实验应用改良的培养基培养神经元至36 d时，对其进行电生理特征测试，记录到BKCa通道电流，其通道特性如大电导，电压敏感性，钙敏感性，TEA对通道的特异性阻断以及通道动力学等均符合BKCa的基本特征[4，9，10]，并与培养6 d的神经元BKCa通道电流特性相比无变异。表明在此培养条件下原代培养可存活至5周以上，且细胞状态良好。
4 结 论
综上所述，本实验对原有培养方法改进后延长了从获得成熟神经细胞到神经元退化之间的时间，使体外原代培养神经元生存期延长，且形态学和生理学特征完好，从而使可用于生物学实验的时间延长，值得推广应用。参考文献：
司徒镇强，吴军正.细胞培养[M] .北京：世界图书出版公司，2007：119-122.
鄂征.组织培养技术及其在医学研究中的应用[M] .北京：中国协和医科大学出版社，2004：65-69.
[3] Robert F， Cloix JF， Hevor T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture[J].Neuroscience， 2012 Jan 3；200：248-60. Epub 2011 Oct 18.
[4] 杨宝峰.离子通道药理学[M] .北京：人民卫生出版社，2005：274-281.
[5] Ghatta S， Nimmagadda D， Xu X， O’rourke ST， Large conductance， calciumactivated potassium channels： structural and functional implications[J]. Pharmacol Ther，110： 103-116.
[6] Ballarin C， Peruffo A. Primary cultures of astrocytes from fetal bovine brain[J]. Methods Mol Biol， 2012；814：117-26.
[7] Meberg PJ， MillerMW. Culturing Hippocampal and Cortical Neural cells[J]. Methods Cells Biol，2003；71（2）：111-127.
[8] Pacifici M， Peruzzi F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells： a quick protocol[J]. J Vis Exp， 2012 May 24
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；（63）. pii： 396