本站原创
摘要：肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是肝脏对各种不同致病因子引起的慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化则是肝纤维化的终末阶段。此时，肝炎病毒、酒精代谢产物、胆汁酸等肝脏毒性物质作用于肝细胞，肝功能显著下降，同时受损肝细胞释放的AST、ALT、TBIL、DBIL、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和纤维形成介质导致自身凋亡。目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效策略，但由于紧张、免疫排斥等理由限制了肝移植的临床运用。由此亟待寻找新的有效治疗策略。细胞治疗是指有活性的细胞替代、修复损伤的组织，进而使组织器官恢复其功能的有效治疗策略。近年来细胞治疗已成为替代器官移植的有效治疗策略。其中干细胞治疗肝硬化等终末期肝病的疗效已得到证实。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，广泛有着于骨髓、脐带组织、脐血、外周血及脂肪等组织中，在特定条件下，可以分化为骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种细胞。MSCs易于提取，低免疫原性，并且具有免疫抑制作用，避开了肝移植的紧张、移植后免疫排斥等不足，被认为是目前最具治疗潜力的供体细胞。有探讨证实间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以分化为功能性肝细胞，修复损伤的肝组织，以而改善肝纤维化和肝硬化；另有探讨发现脂肪源MSCs(adiposetissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)在体外向肝细胞分化历程中经历了间充质细胞向上皮细胞的转变(mesenchymal-to-epithepaltransition, MET)。关于MSCs在体内的动态分化历程及在此分化历程中是否经历了MET尚不清楚。为此，我们构建大鼠肝纤维化及肝硬化模型，经尾静脉注射人脐带源MSCs (human umbipcal cord-derived mesenchymalstem cells, hUC-MSCs)，观察hUC-MSCs对肝纤维化、肝硬化的治疗作用，在体内的动态分化历程及分化的具体机制，为hUC-MSCs治疗肝纤维化及肝硬化提供论述依据。目的：探讨hUC-MSCs在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的动态分化历程及其分化机制。策略：将健康成年雄性Wistar大鼠分为对照组（正常大鼠，CCl_4/sapne0wk，8只），模型组(肝纤维化模型组：CCl_4/sapne4wks，5wks，7wks；肝硬化模型组：CCl_4/sapne8wks，10wks，14wks；每组8只)，MSCs移植组(肝纤维化MSCs移植组：CCl_4/MSCs0wk，1wk，2wks，4wks；肝硬化MSCs移植组；CCl_4/MSCs0wk，2wks，4wks，8wks；每组8只)。采取浓度40%CCl_4橄榄油溶液，按2ml/kg体重的剂量，给予四肢轮流皮射，每周2次；造模成功后模型组及治疗组继续每周2次皮射CCl_4，直至处死。肝纤维化及肝硬化MSCs移植组分别于造模成功后（即CCl_4注射第4周和第7周）经尾静脉注射hUC-MSCs，剂量为5×106个/只，并分别于注射后1、2、4周和2、4、8周处死大鼠。运用血清学检测策略检测大鼠ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL，观察hUC-MSCs移植对大鼠肝功能的影响；采取Haematoxypn and eosinstaining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)和天狼猩红染色法检测肝组织病理转变；采取免疫荧光染色、Western blot和real-timeQ-PCR策略检测各组大鼠肝脏组织中人来源的ALB、AFP蛋白和mRNA的表达，免疫组织化学染色、Western blot和Real time-PCR策略检测人来源的CK18、CK19、vimentin、α-catenin、E-cadherin蛋白和mRNA在大鼠肝组织中的表达，采取Real time-PCR策略检测人来源的N-cadherin。结果：①HE、MT及天狼猩红染色结果显示：CCl_4诱导的大鼠肝纤维化和肝硬化模型成功建立，模型组随给药时间的延长，肝细胞变性坏死及肝内纤维组织沉积逐渐增加；与模型组相比，MSCs移植组肝细胞变性坏死有所减少，HE炎症评分、纤维化程度分级及纤维组织沉积定量浅析结果显示：与模型组相比，除肝纤维化MSCs移植CCl_4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl_4/sapne4wks组相比无显著差别外，肝纤维化CCl_4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组均显示有着显著性差别；②血清学检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组模型中，CCl_4/MSCs1wk组肝功能较CCl_4/sapne4wks组无显著改善，在CCl_4/MSCs2wks组中，ALT、AST较CCl_4/sapne5wks组中的显著降低，ALB、TBIL、DBIL无显著改善；在肝硬化MSCs移植组模型中，CCl_4/MSCs2wks中的ALB较CCl_4/sapne8wks组无显著升高，其余各个时间点MSCs移植组较模型组的肝功能显著好转。③免疫荧光染色及免疫组织化学染色检测结果显示：肝纤维化MSCs移植组中，ALB、AFP、CK18、CK19、E-cadherin及α-catenin表达水平随移植时间的延长表达量逐渐升高，vimentin表达量随MSCs移植时间的延长其含量逐渐下降；在肝硬化MSCs移植组中，随MSCs移植时间的延长，ALB、CK18表达量逐渐增加，vimentin随移植时间的延长其含量逐渐下降，AFP、CK19、E-cadherin及α-catenin在移植后4周较2周组有所增加，移植后8周组较4周组下降，在MSCs移植前以上蛋白均无表达。④运用Western blot检测ALB、AFP、CK18、CK19在大鼠肝脏组织中的表达，在肝纤维化MSCs移植组，CCl_4/MSCs2wks组的ALB、CK18的蛋白表达水平与CCl_4/MSCs1wk组的无显著性差别，而CCl_4/MSCs4wks组的ALB、CK18的蛋白表达较CCl_4/MSCs2wks组的显著升高，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的蛋白表达水平逐渐升高，以上4种蛋白在MSCs移植前均呈阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的AFP、CK19mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的AFP、CK19mRNA较CCl_4/MSCs4wks组显著下降，CK18、ALB的蛋白随MSCs移植时间的延长而表达增加，其上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达。⑤运用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，CCl_4/MSCs2wks组的ALB、CK18mRNA表达水平与CCl_4/MSCs1wk组中的无显著性差别；而CCl_4/MSCs4wks组的ALB、CK18mRNA含量较CCl_4/MSCs2wks组的显著升高，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的mRNA表达水平显著升高；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的AFP、CK19mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组中的AFP、CK19mRNA表达含量较CCl_4/MSCs4wks组的显著下降，CK18、ALB mRNA水平随移植时间的延长而表达显著增加，以上几个指标的mRNA在MSCs移植前均无表达。⑥Western blot检测结果显示，在肝纤维化MSCs移植组中，vimentin蛋白随MSCs移植时间的延长而表达下降，随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin的蛋白表达水平显著增加，以上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl_4/MSCs4wks组显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，以上蛋白在MSCs移植前均无表达。⑦运用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，N-cadherin、vimentin mRNA随MSCs移植时间的延长而表达下降；随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin mRNA的表达显著增加；在肝硬化MSCs移植组，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl_4/MSCs4wks组的显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，N-cadherin、vimentin、E-cadherin及α-catenin在MSCs移植前均无表达。结论：hUC-MSCs移植对大鼠肝纤维化及肝硬化均具有治疗作用，hUC-MSCs分化为肝细胞样细胞是其治疗机制之一；hUC-MSCs在体内向肝细胞的转化是一个动态分化的历程，在此分化历程中hUC-MSCs经历了MET。关键词：肝纤维化论文肝硬化论文hUC-MSCs论文肝细胞论文分化论文
摘要4-8
ABSTRACT8-13
前言13-15
材料与策略15-32
结果32-40
附图40-58
附表58-59
讨论59-63
结论63-64