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摘要：我国人口老龄化日益严重！最新数据显示，2050年80岁以上人口将几乎是现在的四倍，达到3.95亿人。缺血性脑卒中，是危害中老年人健康的“头号杀手”，然而，目前临床上仍然缺乏预防和治疗脑卒中的有效手段，由此预防和减轻脑缺血造成的神经损伤具有重大的临床和社会价值。文献报道，多种非缺血预处理可诱导“脑缺血耐受”，减轻缺血再灌注对神经细胞的损伤，减小脑梗死面积，改善神经功能。其中电针预处理因为安全方便、简单可靠，临床运用前景光明，但其作用机制仍未完全阐明。本实验小组前期探讨表明，电针预处理可能通过上调Notch通路，进而激活脑内某些重要因子或者通路，调节神经细胞内凋亡与抗凋亡的平衡，推动细胞存活；PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的抗凋亡通路，为心脑保护关键分子机制，介导包括电针在内多种预处理的神经保护作用；在神经干细胞和多种肿瘤细胞内发现，Notch通路的激活可推动PI3K/Akt激活，进而调节细胞的增殖、分化和存活。那么，重复电针预处理是否是通过Notch/PI3K/Akt途径诱导脑缺血耐受呢？第一部分电针预处理对缺血再灌注后大脑皮层中Notch和PI3K/Akt通路活性的影响1策略1.1电针预处理对Notch1-NICD，pAkt（Ser473）表达的影响雄性SD大鼠18只随机分为两组：缺血再灌注组（Con）和电针预处理组（EA）。EA组：重复电针刺激百会穴5天，最后一次电针24h后制备MCAO模型；Con组：重复钠麻醉5天，不给予电针刺激，其余处理同EA组。两组分别于缺血前即刻、再灌后2h、再灌后24h随机取3只大鼠，Westernblot策略检测缺血半暗带[1]大脑皮层Notch1-NICD，pAkt（Ser473）的表达。1.2电针预处理后Notch1-NICD阳性细胞和pAkt（Ser473）的分布和细胞定位雄性SD大鼠18只，分组及处理策略同上。运用免疫荧光染色策略检测各组大鼠大脑皮层中Notch1-NICD和pAkt的组织定位和细胞定位。2结果2.1电针预处理对缺血再灌注后大脑皮层中Notch通路活性的影响NICD是Notch通路活化的标志之一。缺血再灌注(I/R)前，EA组与Con组Notch1-NICD含量比较无统计学差别；I/R后2h和24h，缺血侧皮层中Notch1-NICD持续升高，但EA组均显著高于Con组(P0.05)。免疫荧光双标染色发现，再灌注后24h缺血侧皮层中，EA组Notch1-NICD阳性细胞显著多于Con组，EA组Notch1-NICD与NeuN双标的阳性细胞数也显著多于Con组。2.2电针预处理对缺血再灌注后大脑皮层中PI3K/Akt通路活性的影响EA组I/R前，Akt磷酸化水平显著较对照组增强（P＜0.05）；I/R2h时，Akt磷酸化水平达高峰，且显著高于相同时间点Con组（P＜0.05）；I/R24h时，EA组与Con组间Akt磷酸化水平相仿，均较I/R2h显著降低，但仍显著高于I/R前水平。免疫荧光双标染色发现，再灌注后2h缺血侧皮层中，EA组pAkt阳性细胞显著多于Con组，EA组pAkt与NeuN双标的阳性细胞数也显著多于Con组。第二部分阻断PI3K/Akt通路激活对电针预处理诱导的脑缺血耐受效应的影响1策略1.1验证侧脑室注射策略成年SD大鼠两只，侧脑室立体定位[2]：Bregma点旁开0.9㎜，向后1.5㎜，深度3.8㎜，侧脑室注射亚甲兰染料，15分钟后断头取脑，观察大脑蓝色分布区域。1.2验证LY294002对PI3K/Akt通路的阻断作用雄性SD大鼠9只随机分为3组：Sham组，缺血再灌注组（Con）和PI3K/Akt抑制剂LY294002组（LY294002）。Sham组不做任何处理；Con组：同第一部分；LY294002组：侧脑室注射LY294002，终浓度10mM，共10μ l；1h后行MCAO模型制备。再灌注后2h，断头取脑。运用Western blot策略检测缺血半暗带皮层pAkt(Ser473)表达，观察PI3K/Akt是否被阻断。1.I3K/Akt通路抑制剂对电针预处理的脑保护作用的影响雄性SD大鼠40只，随机分为5组（n=8）：Sham组、Con组、EA组、LY294002组和Vehicle组。Sham组：不做任何处理；Con组：同第一部分；EA组：同第一部分。LY294002组和Vehicle组重复电针刺激百会穴5天，在MCAO模型前1h，经侧脑室注射LY294002或Vehicle，于MCAO后24h行神经行为学评分和脑梗死容积百分比检测。2结果2.1LY294002可有效阻断PI3K/Akt通路Western blot显示，LY294002组大鼠大脑皮层中Akt磷酸化水平显著低于Con组(P0.05)，证实LY294002（浓度为10mM）有效阻断PI3K/Akt信号通路激活。2.2PI3K/Akt通路抑制剂对电针预处理的脑保护作用的影响再灌注后24h，EA组与Con组比较，神经行为学评分升高（P＜0.05），脑梗死容积百分比显著下降(P＜0.05)。侧脑室注射PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组较EA组的神经行为学评分降低(P0.05)，脑梗死容积百分比升高（P0.05）；而Vehicle组神经行为学评分及脑梗死容积百分比与EA组均无统计学差别。第三部分阻断Notch通路对PI3K/Akt通路在电针预处理中活性的影响1策略1.1验证DAPT对Notch通路的阻断效果成年雄性SD大鼠12只，随机分为4组：空白对照组（Sham组），电针预处理组（EA组），溶剂对照组（EVM组）和DAPT抑制剂组（EDM组）。Sham组不做任何处理；EA组处理同第一部分；EVM组：电针前3h或者行MCAO术前3h，均侧脑室注射与EDM组相同浓度、相同剂量的DMSO，其余处理同EA组；EDM组侧脑室注射DAPT，其余同EVM组。再灌注后24h，断头取脑。Western blot策略检测缺血半暗带皮层中Notch1-NICD的蛋白表达水平变化。1.2阻断Notch通路在电针预处理中的激活，观察PI3K/Akt通路的变化采取1.1中所提取蛋白，Western blot策略检测缺血半暗带皮层中pAkt（Ser473）的蛋白表达水平有无变化。2结果2.1DAPT可有效阻断Notch通路激活Western blot显示，EDM组皮层中Notch1-NICD含量显著低于其他组(P0.05)，证实DAPT（浓度为50mM）有效阻断Notch信号通路激活。2.2Notch通路在电针预处理中被阻断后，Akt磷酸化水平部分下降Western blot显示，EDM组pAkt（Ser473）蛋白表达水平较EVM组和EA组显著下降(P0.05)，但仍高于Sham组(P0.05)。3结论3.1电针可激活大鼠皮层内的PI3K/Akt信号通路；缺血再灌注可激活大鼠皮层内的PI3K/Akt信号通路；电针预处理可上调PI3K/Akt信号通路缺血再灌注后的活化程度。3.2电针预处理可诱导脑缺血耐受；阻断PI3K/Akt信号通路，电针预处理的脑保护作用减弱；PI3K/Akt信号通路可能介导了电针预处理诱导的脑缺血耐受的产生。3.3在电针预处理诱导脑缺血耐受产生的历程中，Notch通路与PI3K/Akt具有较好的伴随联系；而阻断Notch通路，PI3K/Akt的激活受到显著抑制；在电针预处理历程中，PI3K/Akt可能为Notch的下游通路。Notch/PI3K/Akt通路可能是电针预处理诱导脑缺血耐受产生的主要途径之一。关键词：脑缺血论文再灌注损伤论文电针论文预处理论文缺血耐受论文Notch通路论文PI3K/Akt通路论文
缩略语表5-7
中文摘要7-13
Abstract13-20
前言20-21
文献回顾21-31
实验材料31-33
1 主要仪器31-32
2 主要试剂32-33
第一部分33-40
1 策略33-36
2 结果36-40
第二部分40-44
1 策略40-43
2 结果43-44
第三部分44-50
1 策略44-45
2 结果45-46
3 讨论46-50
小结50-51