丁酸丁酸钠对重症急性胰腺炎大鼠查抄袭率

[摘要]　目的　探讨丁酸钠（NaB）对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响。　方法　30只SD大鼠分成对照组、SAP组及NaB治疗组，每组各10只，采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制作SAP动物模型，NaB治疗组为SAP制模5　min后通过股静脉注射NaB（5　mg/kg）。检测血清淀粉酶、胰腺湿干重比值，利用Kusske方法对胰腺组织的病理学改变：水肿、出血、坏死、炎细胞浸润进行计分，TUNEL法检测胰腺腺泡细胞凋亡。　结果　SAP组血清淀粉酶与对照组比较明显升高，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组血清淀粉酶较SAP组明显下降，差异有统计学意义（P　<　0.05）；SAP组胰腺组织湿/干重比值较对照组下降，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组胰腺组织湿/干重比值较SAP组明显下降，差异有统计学意义（P　<　0.05）。SAP组胰腺损伤积分明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组胰腺损伤积分明显低于SAP组，差异有统计学意义（P　<　0.05）。SAP组胰腺腺泡细胞凋亡指数高于对照组，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组胰腺腺泡细胞凋亡指数显著高于SAP组，差异有统计学意义（P　<　0.05）。　结论　NaB可以促进SAP大鼠胰腺腺泡细胞凋亡，减轻中性粒细胞活化，降低SAP严重程度。
[关键词]　丁酸钠；重症急性胰腺炎；细胞凋亡
[]　A [文章编号]　1673-7210（2012）12（c）-0028-03
重症急性胰腺炎（severe　acute　pancreatitis，SAP）的死亡率及并发症发生率一直较高，治疗效果无法令人满意。有证据表明，细胞凋亡与SAP密切相关，在胰腺炎的发病机制中被认为是一种保护现象，SAP的严重程度与胰腺细胞凋亡呈负相关。丁酸钠（sodium　butyrate，NaB）能够诱导肿瘤细胞和多种非肿瘤细胞的凋亡，但NaB诱导胰腺腺泡细胞以及NaB对SAP及其并发症的治疗作用方面的研究较少，本研究通过建立SAP动物模型，探讨NaB对动物SAP及其并发症的治疗作用，为今后NaB应用于SAP的临床治疗提供实验依据和理论基础。
1　材料与方法

1.1　药品及试剂

NaB及牛磺胆酸钠剂购自美国Sigma公司，试剂纯级，加蒸馏水配制成5%的溶液备用；血清淀粉酶试剂盒（北京科美生物技术有限公司）；TUNEL试剂盒（美国Promega）；SP法免疫组化试剂盒（福州迈新）。

1.2　动物分组及模型制备

健康雄性SD大鼠（吉林大学实验动物中心提供）30只，体重200～250　g，随机分为对照组、SAP组、NaB治疗组，每组各10只。参照Aho等的方法并稍加改进制备SAP动物模型。实验前12　h开始禁食，自由饮水，10%水合氯醛（3　mL/kg）腹腔注射麻醉，上腹正中切口进入腹腔，在肝十二指肠韧带右缘找到胆总管，在手术显微镜下用4号头皮静脉针于十二指肠附近经十二指肠壁穿刺，刺入后用手指捏闭胆总管末端。用微量注射泵向胰胆管内恒速注入5%牛磺胆酸钠（2.0　mL/kg），注射完5　min后拔出针头，双层缝合腹壁。NaB治疗组操作过程同上，即制作另一组大鼠SAP模型，成功后5　min通过股静脉注射NaB　5　mg/kg。对照组仅在开腹后轻轻翻动胰腺。造模后24　h在麻醉下切开腹腔，肉眼观察胰腺、胰周等腹内器官病变情况，腹主动脉采血，静置后离心，留取血清-20℃保存待测淀粉酶，取大鼠部分胰腺组织用中性固定，石蜡包埋，用于胰腺组织常规病理学检查、免疫组化和细胞凋亡的检测，其余胰腺组织进行湿/干重比值的测定，最后处死动物。

1.3　检测指标及方法

1.3.1　血清淀粉酶检测 使用临床全自动生化分析仪测定。

1.3.2　胰腺组织湿/干重比值测定 各组大鼠24　h处死后，切取的胰腺组织于电子天平上称重获得湿质量；再将胰腺组织于60℃烘干24　h，至质量不变为止获得干质量，计算湿/干重比值。
1.3.3　胰腺组织病理学观察 切取各组大鼠胰腺组织用10%液固定，常规制作病理HE切片。光镜下观察胰腺组织病理学改变，参照Kusske等[3]的方法对胰腺损伤进行计分。①水肿：0＝无；1＝轻度叶间隙增宽；2＝重度叶间隙增宽；3＝腺泡间隙增宽；4＝细胞间隙增宽。②坏死：0＝无；1＝坏死面积1%～10％；2＝坏死面积11%～20％；3＝坏死面积21%～30％；4＝坏死面积>　30％。③出血：0＝无；1＝有。④炎性细胞浸润：计数高倍视野下血管周围或小叶内白细胞数量，0＝0～1个；1＝2～10个；2＝11～20个；3＝21～30个；4＝　＞　30个或出现微脓肿。胰腺损伤积分=　①+②+③+④。
1.3.4　胰腺腺泡细胞凋亡检测 TUNEL法检测胰腺组织腺泡细胞凋亡，胰腺组织常规石蜡包埋切片，严格按照说明书操作。细胞核中有出现棕颗粒者为阳性细胞，即凋亡的胰腺腺泡细胞。每张切片染色阳性区域随机选取5个高倍视野（400×），计算500个腺泡细胞中阳性细胞所占的百分比，即为凋亡指数（apoptosis　index，AI）。

1.4　统计学方法

采用统计软件SPSS　11.5对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P　<　0.05为差异有统计学意义。
2　结果

2.1　各组大鼠血清淀粉酶水平及胰腺组织湿/干重比值测定结果

SAP组血清淀粉酶水平明显升高，对照组可能因为翻动胰腺时造成水肿，淀粉酶亦轻度升高。SAP组血清淀粉酶与对照组比较明显升高，差异有高度统计学意义（P　<　0.01）；NaB治疗组血清淀粉酶较SAP明显下降，差异有统计学意义（P　<　0.05）。SAP组大鼠胰腺组织湿/干重比值与对照组比较升高明显，差异有高度统计学意义（P　<

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　0.01）；NaB治疗组胰腺组织湿/干重比值较SAP组下降，差异有统计学意义（P　<　0.05），说明NaB对减轻胰腺水肿有一定作用。见表1。

2.2　各组大鼠胰腺损伤积分及胰腺腺泡细胞凋亡检测结果

正常大鼠胰腺肉眼观呈淡粉红色，薄片状，颜色均匀一致、光泽度好，无水肿，腹腔内无腹水。SAP大鼠胰腺有明显改变，具体表现为，腹腔内有血性腹水，胰腺与周围脏器有粘连，有时可见胰腺片状坏死，腹腔内皂化斑多见。光镜下见腺泡间、小叶间组织水肿，散在炎性细胞浸润，胰腺组织出血、坏死，部分腺泡结构消失。SAP组胰腺损伤积分明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组胰腺损伤积分明显低于SAP组，差异有统计学意义（P　<　0.05）。SAP组胰腺腺泡细胞凋亡指数高于对照组，差异有高度统计学意义（P　<　0.01），NaB治疗组胰腺腺泡细胞凋亡指数显著高于SAP组，差异有统计学意义（P　<　0.05），说明NaB可以有效诱导重症急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞发生凋亡，减轻炎症反应。见表2。
3　讨论
　

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　重症急性胰腺炎的治疗效果仍不能令人满意，究其原因就是对重症急性胰腺炎的发病机制仍未能完全阐明。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主、有序性的死亡，是一种生理性调节机制，不破坏细胞生存环境。Kaiser等[4]通过实验研究发现重症急性胰腺炎标本有大量的坏死组织及脓肿形成，但只有少量凋亡细胞；而急性水肿性胰腺炎标本则出现相对较多的胰腺腺泡凋亡细胞，炎症反应轻。据此推测胰腺腺泡凋亡与急性胰腺炎严重程度呈负相关，腺泡细胞凋亡指数越高则胰腺炎的程度越轻，细胞凋亡在胰腺炎的发病机制中是一种保护现象。
NaB是膳食纤维在肠道中酵解后产生的主要短链饱和脂肪酸。NaB及其稳定的衍生物能够影响多种生理过程，是包括乳腺癌和结肠癌在内的多种肿瘤的生长抑制剂和分化剂。最近的研究证明NaB能够通过多种机制诱导肿瘤细胞和多种非肿瘤细胞的凋亡[5-7]。但NaB诱导胰腺腺泡细胞凋亡以及NaB对SAP及其并发症的治疗作用方面的研究目前较少。本研究结果显示，重症急性胰腺炎大鼠使用丁酸钠可以有效改善胰腺的炎症反应，通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡减轻胰腺的病理损害，继而减轻胰外器官的病理损害，减少并发症的发生，有效改善重症胰腺炎的预后，但是具体机制尚不清楚。
通过本实验结果笔者推断，细胞凋亡是是重症急性胰腺炎病变发展过程中的一个重要特征，并且可能左右病情的演变。细胞凋亡发生时，细胞内的多种酶原释放到细胞外明显减少，细胞生存环境不受破坏，引起炎症反应轻微，诱导胰腺腺泡细胞凋亡可以减轻急性胰腺炎的严重程度[8-10]。
SAP的发生发展是一个复杂过程，有胰酶自身消化学说、白细胞过度激活学说、胰腺微循环障碍学说、细胞凋亡学说等，但均不能圆满解释SAP的发病机制。本研究证实NaB对SAP有治疗作用，为SAP的治疗提供一种崭新的有效方法，但还需结合体外实验及增加炎症介质的检测详细阐述机制，为今后NaB应用于SAP的临床治疗提供实验依据和理论基础。
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（收稿日期：2012-11-13 本文编辑：李继翔）