本站原创1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠40只，雌雄各半，体质量（180±20）g，清洁级，由浙江省医科院实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（浙）2008-0233。动物饲养条件：温度（23±2）℃，自由饮食饮水，照明时间12 h/d，适应性饲养1周后进行实验。1.2 仪器与试剂
低温冰箱（日本三洋公司）；低温4℃离心机（Thermo Scientific，德国）；LD-1001型电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）；SynergyHT 多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）；Olympus 光学显微镜；透射电镜（Hitachi TM-1000，荷兰）。雷公藤甲素标准品由中国药品生物制品检定所提供；大鼠肌红蛋白ELISA试剂盒（美国RB公司）； ZB3-CK-J肌酸激酶试剂盒、H16L-C018乳酸脱氢酶试剂盒均由杭州艾迪康医学检验中心提供。
2.5%的戊二醛溶液，1%和2%锇酸，0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）。
1.3 动物分组和模型制备
40只SD大鼠随机（随机数字源于：免费论文查重站www.udooo.com
法）分为4组：健康对照组、高剂量组（4 mg/kg）、中剂量组（2 mg/kg）及低剂量组（1 mg/kg），每组10只。各组灌胃给药前禁食12 h，除健康组动物给予等量生理盐水灌胃以外，其余各剂量组动物按0.8 ml/100 g一次性给予高、中、低不同浓度药物。给药后24 h、48 h时，以剪尾法获取各组大鼠静脉血，于4 ℃，3000 r/min离心15 min分离血清，-20 ℃冷冻，以备生化指标检测。给药后48 h取静脉血后将全部动物以10%水合氯醛（1 ml/kg）麻醉并处死，分离横切大鼠两侧后肢股外侧肌肉组织约0.5 cm厚的组织块，一部分用10%中性甲醛固定以备病理检查；另一部分用2.5%戊二醛固定，以备透射电镜观察大鼠骨骼肌超微结构用。
1.4 指标检测
1.4.1 血清生化指标测定 采用Olympus全自动生化仪测定大鼠血清肌酸激酶（CK）、肌酐（Cr）、乳酸脱氢酶（LDH）的质量浓度值。1.4.2 肌红蛋白含量测定 以酶联免疫分析法（ELISA）测定大鼠肌红蛋白（Mb）含量，采用双抗体夹心法测定，Mb的标准曲线为y=679.48x+49.428（R2=0.9972），如图1所示。
1.4.3 骨骼肌病理组织学检查 分离的组织块以10%中性甲醛固定，石蜡包埋并切片，常规HE染色，光镜下观察。
1.4.4 骨骼肌超微结构观察 分离的组织块在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定，经漂洗、锇酸固定、再漂洗、乙醇梯度脱水、包埋剂梯度渗透，70 ℃加热，得包埋好的样品。经Reichert超薄切片机切片，柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min，即可在透射电镜下观察。
图1 肌红蛋白（Mb）的标准曲线
1.5 统计学方法
采用SPSS 11.5 统计软件包处理，计量资料以均数±标准差（x ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（LSD-t法）。以P<0.05为差异具有统计学意义。2 结果
2.1 对血清LDH、CK、Cr质量浓度的影响
与健康对照组比较，TP给药后24 h时，各剂量组大鼠血清LDH、CK值均显著升高（P<0.01）；给药后48 h时，高剂量组大鼠LDH值仍显著升高（P<0.01），而中剂量与低剂量大鼠LDH值则不具有统计学意义（P>0.05）；给药后48 h时，各剂量组大鼠血清CK值均较给药24 h时有所降低，与健康对照组血清CK值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各给药组大鼠血清Cr值与健康对照组比较，则无论在任何时间点差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1 各组大鼠给药后24 h、48 h时血清LDH、CK、Cr水平比较（n=10，x ±s）
注：与健康对照组比较，aP<0.01
2.2 对血清Mb含量的影响
TP给药后24h时，高剂量组和中剂量组大鼠血清Mb含量与健康对照组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；给药后48 h时，高剂量组与中剂量组Mb含量较24 h时仍有升高，与健康对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.01），而低剂量组大鼠血清Mb含量则有下降缓解的趋势，与健康对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。与健康对照组比较，aP<0.05，bP<0.01
图2 各组大鼠给药后24 h和48 h时血清Mb水平比较
2.3 对骨骼肌病理组织学的影响光学显微镜下观察可见，健康对照组大鼠的肌肉组织无明显病理改变；而用药后48 h时大鼠肌纤维肿胀，周围可见少量的炎性细胞，横纹肌结构不清，细胞膜皱缩不光滑，细胞核串联聚中。高剂量组大鼠肌纤维断裂呈鼠尾状，出现严重水肿及颗粒变性等病理改变。病理结果见图3。
A：健康对照组；B：TP高剂量组；C：TP中剂量组；D：TP低剂量组
图3 给药后48 h时各组大鼠骨骼肌病理组织学改变结果（×10）
2.4 骨骼肌超微结构变化
图4为各组大鼠骨骼肌在×24000透射电镜放大倍数下，观察到的大鼠骨骼肌超微结构。健康对照组大鼠肌纤维排列整齐，横纹肌结构清楚均匀，电镜显示肌原纤维排列整齐，可见明暗条纹及“Z”带和中间“M”线，核染色质分布均匀，线粒体、内质网无肿胀，糖原颗粒丰富，结构清晰，肌膜完整。给药48 h后，肌原纤维“Z”带消失，肌细胞固缩，核染色质聚集，线粒体严重肿胀（图中红色箭头所指部位）。各给药剂量组均有不同程度横纹肌溶解现象（图中黄箭头所指部分），其中以高剂量组大鼠横纹肌溶解最为严重。A：健康对照组；B：TP高剂量组；C：TP中剂量组；D：TP低剂量组
图4 给药后48 h时各组大鼠骨骼肌（电镜×24000）
3 讨论
随着雷公藤制剂临床的广泛应用，它的不良反应也日益受到人们的关注。临床观察统计，雷公藤的不良反应发生率为58.1%，主要为内脏系统（肝、胃肠、肾、心脏）、生殖系统、血液系统、免疫器官和皮肤黏膜损害，而雷公藤制剂引起横纹肌溶解症的相关研究还未见报道。横纹肌溶解症（rhabdomyolysis，RL）是由于骨骼肌组织损伤，改变肌细胞膜的完整性，导致肌红蛋白和其他细胞内容物向血液循环释放而引起的机体损伤和其他并发症。RL可对机体造成严重损害，如造成急性肾衰竭、严重心律失常、血容量减少性休克、酸毒症、恶性高热、弥漫性血管内凝结等[9]。急性肾功能衰竭是其严重并发症之一，约有10%～40%的RL患者并发有急性肾功能衰竭[10]。因此，应重视雷公藤制剂对骨骼肌组织的损害，早期防范肌毒性的产生，以免因RL而使机体产生严重甚至致命的多脏器衰竭。
本实验研究中，TP能显著升高正常大鼠给药后24 h时血清LDH、CK水平，以及给药后24 h、48 h时大鼠血清Mb含量，提示TP对骨骼肌存在损害作用。HE染色病理切片结果也提示存在着严重的肌组织的损伤以及炎性细胞的浸润；透射电镜下观察到明显的肌原纤维溶解和线粒体、内质网的肿胀和崩解，提示光镜与电镜组织学结果的一致性，从而证实了TP具有溶解横纹肌的毒性作用[11]。并且TP的急性骨骼肌毒性具有剂量相关性，存在剂量一效应关系；同时，超微结构改变提示TP的骨骼肌毒性可能与线粒体损伤、细胞膜破坏有关。当肌肉损伤后2～12 h，血清CK开始上升，1～3 d达到高峰期，然后开始降低[11]。目前通常以血清CK水平高于正常值高限的5～10倍（即CK>1000 U/L或CK>2000 U/L）做为诊断横纹肌溶解症的标准。目前还没有足够的证据表明CK水平的高低与急性肾功能衰竭的发生率相关。本实验中，血清中肌酐水平正常，说明TP在48 h内还没有对肾脏造成损伤。
参考文献
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（收稿日期：2013-02-01）
（本文编辑：沈惠云）