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摘要：阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统变性疾病,以进行性多项认知损害为主要体现的综合征。患者脑中三大病理特点为淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经纤维缠结及神经元丢失。近年来细胞内Aβ、线粒体功能紊乱在AD发病中的作用已成为探讨热点。淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)位于线粒体基质,催化醛、酮、醇及类固醇等的氧化或还原。Aβ有着时,Aβ可与ABAD结合,使后者构象转变,引起细胞内氧化应激可致细胞死亡。而无Aβ环境下,ABAD在应况下对机体有保护作用。为更好探讨ABAD与Aβ结合后在AD发病中的作用及ABAD本身的生理作用,建立ABAD基因敲除小鼠模型是一探讨基础。目前已成功新建立神经元内选择性ABAD基因敲除小鼠模型。本实验对该小鼠一般性状、特点,及线粒体功能,且对于引起人类MHBDD疾病的ABAD三个突变位点进行了初步的探讨,为ABAD在线粒体内的功能提供一些线索。第一部分选择性ABAD基因敲除对小鼠神经细胞及其线粒体功能影响的初步探讨目的：选择性神经元内ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型,需要明确其基本特点及神经细胞线粒体功能。探讨神经元内ABAD表达量下降导致线粒体功能紊乱的可能理由。策略：利用CREB PCR及FLOX PCR鉴定ABAD ko小鼠基因型。利用westernblot及免疫荧光染色鉴定ABAD在其大脑皮层及海马表达量。TMRM荧光染色了解线粒体膜电位变化,MitoSOX荧光染色观察线粒体氧自由基的释放,用ATP试剂盒测定脑组织ATP含量,TUNEL试剂盒染色观察神经细胞凋亡情况。免疫荧光染色及Western blot观察MHB、CypD及其它多种蛋白表达量的转变。用ImageJ对Western blot条带及荧光染色进行量化,通过标准曲线换算ATP脑组织含量,对TUNEL阳性的细胞及神经元进行计数等,用student t test比较基因敲除小鼠与对照小鼠的差别。结果：ABAD ko小鼠基因型为CREB(+)且FLOX Δneo。Western Blot结果提不ABAD ko小鼠皮层及海马ABAD的表达量显著下降,密度值分别为皮层0.81±0.129vs.0.29±0.031, P=0.00098,海马1.74±0.144vs.1.00±0.160,P=0.01894。免疫荧光染色提示ABAD ko小鼠上面陈述的部位ABAD表达量下降。MHB染色发现ABAD ko小鼠皮层MHB较wt小鼠显著增加,密度值为11.14±0.609vs.6.92±0.354,P=0.018,海马中ABAD ko小鼠MHB密度值较wt小鼠高,但P=0.48,无统计学差别。ABAD ko小鼠内嗅皮层中TMRM染色显著减低(1.00±0.081vs.0.75±0.049,P=0.036),运动感觉皮层无显著降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠内嗅皮层中显著升高(1.00±0.062vs.1.37±0.085,P=0.004),而在运动感觉皮层无统计学差别(P=0.336)。脑组织ATP含量测定ABAD ko小鼠数值相对低,但两组小鼠无统计学差别,可能取脑时间及部位不同影响结果(wt小鼠脑ATP含量2.54±0.282,ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210,P=0.264)。TUNEL染色发现7-8月ABAD ko小鼠皮层及海马均有TUNEL阳性细胞,较对照组显著升高,且内嗅皮层区神经元与总神经细胞比值显著下降,提示有神经元丢失(ABAD ko小鼠内嗅皮层神经元与总细胞比值0.298±0.069,wt小鼠0.67±0.050,P=0.032),而3-5个月的ABAD ko及wt小鼠大脑皮层或海马中均无TUNEL阳性染色,且皮层运动感觉区及内嗅皮层均无显著神经元丢失。另外Westernblot结果发现CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠脑组织中显著升高,COXIV、PSD95、Synaptophysin等表达量显著下降。结论：ABAD ko小鼠的基因型为CREB(+)且FLOX Δneo,皮层及海马神经元中ABAD表达量显著降低,其底物MHB在上面陈述的部位堆积,为导致下游膜电位下降,ROS增加及细胞凋亡的理由之一。ABAD ko小鼠脑中CypD表达量升高,可能为导致线粒体功能紊乱的另一理由。ABAD ko小鼠大脑皮层中内嗅皮层损伤严重。GFAP, SODII,Nrf2表达量上升,可能与星形胶质细胞增生对抗细胞内氧化应激有关,PSD95、Synaptophysin表达量降低,提示突触功能受影响。第二部分ABAD及三种突变体对氧化应激损害反应的探讨目的：人类疾病MHBDD是由ABAD基因某些位点的点突变引起。既往认为是突变造成ABAD对MHB酶活性下降导致MHB在脑内堆积引起发病,而最近有报道认为还有其它途径损伤线粒体。由此,本探讨建立空载体转染、wtABAD转染及三个mutABAD转染的稳定细胞系,观察wtABAD及三种突变体对氧化应激损害的反应,探讨ABAD突变引起线粒体功能紊乱的可能途径。策略：建立稳定表达的空载体,wtABAD,三个mutABAD(R130C, D86G, Q165H)的SK-N-SH细胞系。用Western blot检验ABAD表达量,AEC染色鉴定细胞形态及纯度。选出合适的克隆后,加入H12O2诱导氧化应激,用MTT试剂盒、ATP试剂盒,测定各个细胞系中细胞的存活、生长及细胞内ATP含量的变化。两组间MTT数值及ATP含量差别用student t test检验。结果：wtABAD组与空载体转染的对照相比,H2O2处理24小时浓度为25uM,50uM,100uM组及处理48小时浓度为25uM,50uM组,MTT值显著升高(P0.05)。wtABAD转染的ABAD表达量不同的克隆里,对氧化应激均具有显著保护作用,且ABAD表达量低,保护作用相对好,H2O2浓度高时保护作用更显著。mutABAD组里,100uM H202处理细胞24小时后MTT发现,R130C及Q165G组MTT值与对照相比无统计学作用差别(R130C:0.80±0.033VS.0.73±0.059,P=0.340:Q165H:0.80±0.033VS.0.89±0.050.P=0.162),D86G组数值显著下降(0.80±0.033VS.0.48±0.011,P=O.011).250uM H202处理细胞24小时后MTT发现,D86G.R130C数值显著下降(D86G:0.50±0.076vs.0.08±0.002,P=0.001;R130C:0.50±0.076vs.0.15±0.021,P=0.001),Q165H数值上升(0.50±0.076vs.0.69±0.019,P=0.030)。ATP结果提示H2021O0uM,200uM处理24小时后,对照组ATP含量较wtABAD组显著降低(100uM:0.90±0.086vs.1.18±0.079,P=0.036;200uM:0.66±0.071vs.1.07±0.092,P=0.006).50uM H202处理,wtABAD至48小时ATP含量无显著下降,而对照组ATP含量显著下降(24hr:1.01±0.066vs.0.95±0.081,P=0.391;48hr:0.83±0.032vs.1.05±0.071,P=0.036).而三个mutABAD组,100uM及200uM H2O2处理细胞24小时后测定ATP发现,ATP值与对照相比均无显著升高。结论：H2O2引起的氧化应况下,wtABAD转染SK细胞克隆对细胞均有保护作用,而三种mutABAD转染的细胞,MTT结果提示D86G、R130C可能对细胞有着进一步损伤作用,Q165H可能有着保护作用,ATP含量同对照组无显著差别。推测突变通过影响其它底物酶活性或CypD相关途径对线粒体功能产生损害,需要进一步实验证实。关键词：阿尔茨海默病论文淀粉样蛋白结合醇脱氢酶论文选择性基因敲除小鼠论文线粒体论文氧化应激论文凋亡2--3-羟基丁酰辅酶A缺乏症论文
摘要6-9
Abstract9-13
前言13-25
69第二部分 ABAD及其三种突变体对氧化应激损害反应的探讨69-93
材料和策略69-79
结果79-89
讨论89-90
小结90-91