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摘要：第一部分亚慢性铝暴露对大鼠神经行为影响及其机制探讨铝(aluminum, Al)是地壳中第三大化学元素,也是含量最多的金属元素,铝及其化合物在日常生活、生产中运用广泛,可通过饮水、食物、药物、烹调用具及粉尘等多种途径进入人体。铝是公认的强神经毒素,也是引起阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等多种神经退行性疾病的重要环境危险因素之一。铝在AD发生中的作用仍有争议,可能与实验用含铝化合物的种类及其在生理pH值条件下的化学形态有关。麦芽酚铝[aluminum-maltolate, Al(mal)3]是一种呈电中性的含铝复合物,在pH=7时能形成亚稳溶液,有利于进行铝神经毒性的相关探讨。行为学转变是铝神经毒性的早期监测指标;海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)足一个公认的与学习记忆有关的电生理模型；铝的过量接触和蓄积可损害学习记忆功能,导致老年痴呆样病症；神经系统病理转变是铝致认知功能损害的基础。本部分内容采取亚慢性腹腔注射Al(mal)3染毒SD大鼠建立神经系统损伤模型,以神经行为学、电生理、组织病理学及体内铝蓄积探讨铝的神经毒性。第一章亚慢性铝暴露对大鼠神经行为的影响目的：探讨Al(mal)3对大鼠神经系统的毒性作用。策略：采取Morris水迷宫(Morris water maze. MWM)、旷场实验(open field test. OFT)对2月龄健康雄性SD大鼠进行行：为学筛查,取学习记忆能力在5%-95%范围内的大鼠40只作为探讨对象,按体重随机分为4组：生理盐水组、10μM/kg、20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3染毒组。采取亚慢性腹腔注射Al(mal)3进行染毒,0.2ml/d,共60d。采取MWM、跳台实验(step-down test, SDT)、避暗实验(step-through test, STT)测定大鼠学习记忆能力；采取OFT测定大鼠自主活动能力。结果：亚慢性腹腔注射Al(mal)3染毒可导致大鼠MWM定位航行实验潜伏期相对延长,但差别无统计学作用(P0.05);空间探讨实验中,与生理盐水组比较,20μM/kg.40μM/kg Al(mal)3染毒组找到平台时间显著延长(P0.05)；各Al(mal)3染毒组穿越原平台位置次数显著减少(P0.05)。相关浅析显示,铝暴露剂量与找到平台时间(rs=0.664,P0.05),穿越平台位置次数(rs=-0.641,P0.05)之间有着显著相关联系。SDT实验发现,Al(mal)3染毒组潜伏期显著缩短^,错误次数1和2显著增加,除低剂量Al(mal)3染毒组错误次数2外,其他各染毒组上面陈述的三指标与生理盐水组比较,均具有统计学作用(P0.05)。染毒组大鼠STT潜伏期逐渐缩短,错误次数1和2逐渐增加,与生理盐水组相比,差别有统计学作用(P0.05)。相关浅析显示,铝暴露剂量与学习成绩(rs=0.789,P0.01),潜伏期(rs=-0.708,P0.01),记忆成绩(rs=0.466,P0.05)之间有着显著相关联系。在OFT中,随染毒剂量的升高,各染毒组大鼠格停留时间显著延长,竖起次数、跨格次数显著减少,除低剂量染毒组竖起次数外,其余各染毒组上面陈述的观察指标与生理盐水组相比,均有统计学作用(P0.05)。结论：亚慢性Al(mal)3染毒对大鼠神经系统具有显著损伤作用。第二章亚慢性铝暴露对大鼠LTP的影响目的：探讨亚慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠海马LTP的影响。策略：神经行为测试后,以每组随机取4只大鼠,采取电生理学策略进行海马LTP的测定。结果：与生理盐水组相比,Al(mal)3染毒组大鼠海马LTP受到显著抑制(P0.05)。除10μM/kg Al(mal)3组在高频刺激后10min外,各Al(mal)3染毒组在高频刺激(high-frequency stimup, HFS)后其余各时点与生理盐水组相比,标化的群体兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)的振幅显著降低(P0.05)。结论：Al(mal)3可抑制大鼠海马CAl区LTP。第三章亚慢性铝暴露对大鼠海马形态结构的影响目的：探讨亚慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠海马形态结构的影响。策略：采取HE染色、普通光镜观察海马的大体结构,采取透射电镜观察海马的超微结构。结果：光镜观察发现,生理盐水组海马区神经细胞排列整齐,随着染铝剂的增高,细胞排列逐渐变凌乱,高剂量组可见细胞连接松懈,细胞核固缩,细胞周围出现环状带。电镜下可见生理盐水组细胞核形态规则,染色质分布匀匀,线粒体形态规则,嵴排列整齐,而随着染铝剂量的增高,细胞核皱缩,染色质边聚,核膜破裂,线粒体逐渐出现肿胀,破裂并可伴有线粒体嵴减少或消失。结论：亚慢性Al(mal)3染毒可导故大鼠海马结构严重受损。第四章亚慢性铝暴露对大鼠血铝、脑铝含量的影响目的：探讨亚慢慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠脑铝、血铝含量的影响。策略：动物分组及染毒同第一章,LTP测试结束后,采取石墨炉原子吸收分光光度法(graphite furnace atomic absorption spectrometry)测定大脑皮质、血清中铝含量。结果：脑铝含量均随染毒剂量的升高而增高,与生理盐水组比较有统计学差别(P0.05)。结论：亚慢性Al(mal)3染毒可导致大鼠体内铝蓄积。第二部分铝暴露对淀粉样蛋白生成的影响AD是以进行性记忆减退、认和障碍和人格转变为主要临床体现的神经退行性疾病,老年斑(senile plaques, SPs)、神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles. NFTs)和神经元丢失是其特点性病理体现。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)是构成SPs的主要成分,也是NFTs及血.管淀粉样变性的生化基础。Ap是种由40-43个氨基酸所构成的难溶性蛋白质,由淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor. APP)经淀粉样裂解途径所产生。Aβ的过度产生和蓄积可能是各种理由诱发AD的共同途径,是AD形成和进展的关键因素。长期摄入美国居民日常膳食规定铝量可导致大鼠海马和大脑皮层的APP过度表达,引起Aβ级联反应;大鼠神经元细胞暴露于亚致死浓度的三氯化铝(50μM)3周以上,可出现Aβ免疫阳性沉淀；铝可推动Aβ由α-螺旋向β-片层结构转变,加速Aβ生成和聚集,增加Aβ低聚物的稳定性。有探讨认为铝可能通过直接影响Aβ合成代谢而导致实验动物脑内Aβ含量增加,但其确切机制目前尚不清楚。解聚素和金属蛋白酶-10(Adisintegrin and metalloproteinase-10, ADAM10)是最主要的α-分泌酶。APP的β-位点裂解酶1(β-site AβPP cleing enzyme, BACE1)被认为是脑中涉及到Aβ产生的主要β-分泌酶。早老素1(presenipn1,PS1)是γ-分泌酶的重要催化成份。γ-分泌酶对APP的裂解能够产生Aβ40和Aβ42。Aβ42更易水解和形成原纤维,是AD老年斑的主要成份。本部分将采取动物实验、体外实验,分别对APP淀粉样物质代谢途径和非淀粉样物质代谢途径中的APP、ADAM10/17/9、BACE1和PSl的基因、蛋白表达,BACE1活性及Aβ40和Aβ42含量进行测定,探讨铝对APP代谢的影响。第一章亚慢性铝暴露对大鼠淀粉样蛋白生成的影响目的：探讨Al(mal)3对大鼠APP分解代谢的影响。策略：动物分组及染毒同第一部分,分别采取ELISA、qRT-PCR测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1和PSI的基因、蛋自表达,采取ELISA法测定BACE1酶活性及Aβ40和Aβ42含量进行测定。结果：随Al(mal)3暴露剂量的升高,大鼠皮质APP蛋白、基因表达逐渐增加,高剂量组APP蛋白、基因表达与生理盐水组比较,具有统计学差别(P0.05)。高剂量Al(mal)3染毒组ADAM10、ADAM17和ADAM9的蛋白和基因表达较生理盐水组显著降低,差别具有统计学意作用(P0.05)。中、高剂量Al(mal)3染毒组BACEl基因表达和蛋白含量与生理盐水组比较,均具有统计学差别(P0.05)。中、高剂量。Al(mal)3染毒组BACEl酶活性与生理盐水组比较显著升高,具有统计学作用(P0.05)。PSI蛋白表达随Al(mal)3染毒剂量的升高而逐渐增加,各Al(mal)3染毒组PSI蛋白含量与生理盐水组比较均具有统计学作用(P0.05)。随染毒剂量的升高,Aβ40含量逐渐降低而Aβ42含量逐渐升高,中、高剂量Al(mal)3染毒组Aβ40含量与生理盐水组比较具有统计学差别(P0.05)。低、中、高剂量Al(mal)3染毒组Aβ42含量与生理盐水组比较具有统计学作用(P0.05),结论：铝可通过增强APP的淀粉样水解,抑制其非淀粉样水解而导致Aβ42生成增加。第二章铝暴露对PCl2细胞淀粉样蛋白生成的影响目的：控讨Al(mal)3染毒对PCl2细胞APP分解代谢的影响。策略：PC12细胞在Al(mal)3终浓度为0,50,100,200,400pM的培养基中培养12h,24h,48h后,采取ELISA法测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1、PS1、Aβ40和Aβ42蛋白含量,采取qRT-PCR测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1、PS1基因表达,采取ELISA法测定BACE1酶活性。结果：400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,其APP蛋白、基因表达显著增加,与对照组比较具有统计学差别(P0.05)。50,100,200,400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,ADAM10蛋白和基因表达均显著下降,与对照组比较,差别具有统计学作用(P0.05)。50,100,200,400μM Al(mal)3染毒PC12细胞24h,48h后,ADAM17和ADAM9蛋白和基因表达均显著下降,与对照组比较,差别具有统计学作用(P0.05)。Al(mal)3染毒可导致PC12细胞BACE1蛋白、基因表达增加。400μM A1(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,其BACE1蛋白和基因表达与对照组比较显著增加(P0.05)。随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,PC12细胞Aβ40表达逐渐减少而Aβ42表达逐渐增加。结论：体外实验证实,Al(mal)3对APP的淀粉样水解具有显著推动作用,同时对分淀粉样水解具有显著抑制作用。第三部分铝暴露对Reepn信号转导通路的影响脑中Aβ的过度表达是导致AD发病的主要因素。Aβ是由APP经β-,γ-分泌酶连续水解所形成。一些探讨认为,APP和β-分泌酶均有着与细胞表面,被内吞进入内涵体后产生大量Aβ,相关分子机制尚不清楚。Reepn是一种大型的细胞外糖蛋白,Reepn可与细胞膜表面受体ApoER2和VLDLR受体结合,通过胞内衔接蛋白Dab1将Reepn信号转导入细胞内。Reepn信号可引起Dab1依赖的涉及多种激酶的信号级联反应。在神经系统发育期间,可以调节神经元的正确迁移和定位。而且,Reepn信号通路被认为参与了神经退行性疾病的发生。近年来,越来越多的证据表明,Reepn及其信号通路的组分与AD特点病理体现相关。AD转基因小鼠动物模型探讨发现Reepn有着于老年斑中。Dab1可增加转染细胞和原代培养细胞膜表面APP农达,增加APP被α-分泌酶裂解,减少Aβ生成。Reepn可影响Dab1的这种作用。Reepn能够显著增加Dab1和APP的免疫共沉淀,而且,Reepn可减少Aβ产生。由此,Reepn及其信号转导通路成分可能参与了APP的运输及裂解历程。但确切制目前尚不清楚。本部分采取体内和体外实验,探讨Al(mal)3致APP代谢异常历程中Reepn信号转导通路相关成分的表达变化。第一章亚慢性铝暴露对大鼠Reepn信号转导通路相关成分蛋白、基因表达的影响目的：探讨铝暴露对大鼠皮质Reepn及其信号转导通路相关基因表达的影响。策略：动物分组及染毒同第一章,采取ELISA法测定大鼠大脑皮质Reepn、ApoER2、VLDLR、 Dab1蛋白含量,采取qRT-PCR测定大鼠大脑皮质Reepn基因(RELN).ApoER2、VLDLR、 Dab1基因表达。结果：随染毒剂量升高,Reepn蛋白及基因表达逐渐下降,各剂量Al(mal)3染毒组大鼠皮质Reepn蛋白含量及RELN基因表达与对照组比较均具有统计学差别(P0.05)。中、高剂量Al(mal)3染毒组VLDLR基因农达较对照组显著升高而蛋白含量却显著下降,与对照组比较,差别具有统计学作用(P0.05)。各Al(mal)3染毒组大鼠皮质ApoER2基因表达较对照组显著下降(P0.05),高剂量Al(mal)3染毒组大鼠皮质ApoER2蛋白含量较对照组显著降低,差别具有统计学作用(P0.05)。各染毒组Dab1基因表达与对照组比较显著下降,差别具有统计学作用(P0.05),中、高剂量组Dab1蛋白含量较对照组显著降低(P0.05)。结论：亚慢性铝暴露可影响大鼠皮质Reepn信号转导通路相关成分的基因和蛋白表达,铝致Aβ合成异常可能与此有关。第二章铝暴露对PC12细胞Reepn信号转导通路相关成分蛋白、基因表达的影响目的：探讨铝暴露对PC12细胞Reepn及其信号转导通路相关基因、蛋白表达的影响。策略：细胞染毒同第二部分,采取ELISA法测定PC12细胞Reepn、ApoER2、VLDLR、 Dab1蛋白含量,采取qRT-PCR测定PC12细胞RELN、ApoER2、VLDLR、Dab1基因表达。结果：Reepn蛋白和基因表达随染毒剂量升高而逐渐减少,200、400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h和48h,Reepn蛋白和基因表达较对照组显著降低(P0.05)。200、400μMAI(mal)3染毒组VLDLR蛋白和基因表达较对照组显著下降(P0.05)。除50μMAl(mal)3染毒PC12细胞24h外,其余各染毒组PC12细胞染毒12h,24h和48h均可导致ApoER2蛋白和基因表达显著下降(P0.05)。各剂量AI(mal)3染毒PC12细胞24h和48h均可导致Dab1蛋白和基因表达显著下降,与对照组比较具有统计学差别(P0.05)。结论：铝暴露可影响PC12细胞Reepn信号转导通路相关成分的蛋白和基囚的表达。结论：1.铝致Aβ生成增加在铝致学习记忆障碍和AD等神经退行性疾病发生历程中起十分重要的作用。铝致Aβ生成增加的主要机制为：推动BACE1和PSI表达,增加BACE1活性,使APP水解以淀粉样物质途径为主,同时降低ADAM10/17/9表达,进一步减少APP的非淀粉样水解途径：2. Reepn信号转导通路可能参与了铝致APP水解异常、Aβ生成增加历程的调节。关键词：麦芽酚铝论文神经行为论文长时程增强论文血铝论文脑铝论文淀粉样蛋白前体论文淀粉样蛋白论文Reepn信号通路论文
摘要5-10
ABSTRACT10-18
英文缩写18-20
前言20-29