摘要：14-3-3蛋白广泛分布于真核生物中,该蛋白结构保守,存在于细胞内不同区域,参与调控细胞内各种生命代谢。已发表的Glomus mosseae14-3-3基因EST序列,利用反向PCR和3'RACE技术克隆到了Gm14-3-3基因的ORF全长,上游约2 kb长的启动子区和5'UTR以及基因的3'UTR序列；在菌根真菌中发现编码相同蛋白质的基因产生两种具有长短不同3'UTR转录产物的现象,并将两种转录产物分别命名为G.m14-3-3L和G.m14-3-3S。生物信息学的方法对G.m14-3-3基因以及其编码的蛋白质了分析,结果它与其它真核生物中的14-3-3蛋白具有较高的同源性,预测的3D模型具有典型的14-3-3蛋白的结构特征。构建以egfp为报告基因的表达载体,对G.m14-3-3基因的putative启动子在酿酒酵母Y187中了活性分析结果该基因启动子片段能在酵母中发挥功能。序列分析结果,在G.m14-3-3L的3'UTR和G.m14-3-3的ORF区段分别设计特异性引物,利用实时荧光定量RT-PCR技术探索了G.m14-3-3L和G.m14-3-3S在Glomus mosseae的休眠孢子和共生期间菌丝两个不同生长阶段,以及共生期间分别受到重金属Cu、Cd胁迫和盐胁迫时的转录变化,主要结果如下：1)在休眠期的孢子和共生期菌丝中,Gm14-3-3总的mRNA转录量基本相同,但Gm14-3-3L mRNA在休眠期孢子中的含量是共生期菌根根内菌丝含量的1.5倍；2)在200 mg/kg浓度的重金属铜胁迫下,Gml4-3-3总的mRNA含量时间的增加呈现出先降低,后恢复到CK的现象,并在24h处理时转录量下降到CK的1/2,期间G.m14-3-3L和G.m14-3-3S的比例无变化；3)在浓度为60 mg/kg的重金属镉胁迫时,各种时长处理表现出的变化较小,90 mg/kg的镉处理一个月,G.m14-3-3基因的转录量是CK的1.7倍；4)盐胁迫处理条件下,观察到该基因在转录有变化。据此推测G.m14-3-3基因的表达受转录和转录后的调控,并在菌根真菌的生命代谢活动和抵抗环境胁迫中起着作用。,构建原核表达载体成功实现了G.m14-3-3基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达；在保守区段设计引物扩增到了实验室其余三个AM真菌Gigaspora margarita, Glomus intraradices, Gigaspora rosea中14-3-3基因的序列。本研究为后续研究菌根真菌中与14-3-3蛋白的信号通路以及利用14-3-3基因AM真菌菌种鉴定打下了基础。关键词：Gm14-3-3论文RACE论文实时荧光定量PCR论文非翻译区论文
摘要6-7
Abstract7-9
缩略词表9-10
1 前言10-25
1.1 研究问题的由来10
1.2 文献综述10-23
1.2.1 菌根真菌共生机理简介10-12
1.2.2 菌根真菌分子生物学研究进展12-15
1.2.3 菌根真菌种属的分子生物学鉴定15-16
1.2.4 14-3-3蛋白介绍16-19
1.2.5 3'UTR对基因表达的影响19-21
1.2.6 基因全长克隆常用技术21-23
1.3 研究的目的及23-25
2 与方法25-37
2.1 实验和仪器25-27
2.1.1 生物25
2.1.2 试剂25-26
2.1.3 主要仪器设备26-27
2.2 实验方法27-37
2.2.1 G.m14-3-3基因全长的克隆27-31
2.2.2 基因启动子活性分析31-33
2.2.3 G.m14-3-3基因的原核表达33-34
2.2.4 G.m14-3-3基因的转录分析34-36
2.2.5 14.3-3基因在AM真菌鉴定中的初步应用36-37
3 结果与分析37-50
3.1 G.m14-3-3基因全序列克隆结果37-42
3.1.1 Glomus mosseae孢子基因组DNA的抽提结果37
3.1.2 反向PCR结果与分析37-38
3.1.3 3'RACE结果38-40
3.1.4 G.m14-3-3基因的生物信息学分析40-42
3.2 启动子分析结果42-43
3.2.1 表达载体构建结果42-43
3.2.2 启动子缺失结果分析43
3.3 G.m14-3-3基因在大肠杆菌BL21中的初步表达结果43-44
3.4 荧光定量PCR实验结果与分析44-46
3.4.1 G.m14-3-3基因在休眠孢子和根内菌丝中的转录区别44
3.4.2 G.m14-3-3基因在重金属和盐胁迫下的转录变化44-46
3.4.3 荧光定量PCR结果分析46
3.5 14-3-3基因在四种AM真菌种属中的扩增及种属区分应用46-50
3.5.1 以14-3-3基因为基础的探针引物设计结果46-47
3.5.2 Nest-PCR引物验证结果47-48
3.5.3 14-3-3基因对四种AM真菌的分类48-50
4 讨论50-54
4.1 菌根真菌基因全长的克隆50
4.2 菌根真菌基因功能在酵母中的验证50-51
4.3 G.m14-3-3基因的转录和转录后调控51-52
4.4 不同种属AM真菌中14-3-3基因的研究52-54
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