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摘要：登革病毒(Dengue viruses, DENV)是一类严重危害人类健康的虫媒病毒,包括四个血清型(DENV1～4),该病毒主要伊蚊叮咬传播。据统计,全世界有超过25亿人处于登革病毒的威胁之中,登革病毒感染已经严重的世界性公共卫生问题。不同血清型登革病毒刺激机体产生的抗体不能起到交叉保护作用以及存在ADE效应,给登革疫苗的研制带来了极大挑战。登革病毒的预防主要依赖于切断蚊媒传播,尚无被批准的商业化疫苗。病毒样颗粒(Virus-pke particles, VLPs)具有与天然病毒的免疫原性而无感染性,是一种较为理想的候选疫苗抗原。登革病毒为单正链RNA病毒,基因组长约11kb,含单一开放读码框,依次编码3种结构蛋白(C、prM/M和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。E蛋白为主要的包膜糖蛋白,是登革病毒的主要保护性抗原。prM蛋白是膜蛋白M的前体,是形成病毒颗粒的膜蛋白并且有助于E蛋白结构的稳定。prM和E双基因的联合表达可以形成VLPs。2009年7月,我国浙江省义乌市爆发了登革热疫情,经实验室诊断为登革3型病毒感染所致。本研究对2009年登革3型病毒义乌流行株系统进化分析,构建基于prM/E基因的登革毒样颗粒分泌表达质粒,在哺乳动物表达系统中了分泌表达的登革VLPs并对其免疫原性初步研究,为登革病毒样颗粒疫苗的研究及登革病毒诊断抗原的制备奠定了基础。本研究主要分为三：一、登革3型病毒2009年义乌流行株系统进化分析浙江省义乌市登革病毒流行统计学分析,描述其流行病学特征。提取义乌流行株病毒RNA,利用RT-PCR法登革3型病毒义乌流行株全基因组序列。从GenBank中选取不同地区不同年份的60株登革3型病毒全基因组序列,并选择登革病毒中国流行株(其中3株登革1型,2株登革2型,1株登革4型)作为外群,用MEGA4序列比对及同源性分析,Neighbor-joining (NJ)法建立系统发生树,并用Bootstrap值为1000评价系统发生树。系统进化分析义乌流行株与广州GZ1D3株(GB：GU363549)及印度GWL-25株(GB：AY770511)度最高,氨基酸序列同源性分别为99.76%和99.64%。义乌流行株属于登革3型病毒亚型Ⅲ。二、利用哺乳动物表达系统表达登革3型病毒VLPsPCRprM/E基因,融合PCR的方法在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽序列并同时删除E蛋白羧基末端的20%或替换为乙脑病毒E蛋白相应的,基因JprME、JprME397、JprME397J,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT中,经过酶切鉴定和测序鉴定后,三种读码框架及序列正确的重组质粒D3YWJprME-pcDNA5/FRT, D3YWJprME397-pcDNA5/FRT, D3YWJprME397J-pcDNA5/FRT。运用脂质体法分别将重组质粒转染293T细胞瞬时表达,利用间接免疫荧光法和Western印迹法分别检测prME蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况。结果三种重组质粒转染293T细胞后均有登革3型病毒蛋白的表达。转染了D3YWJprME-pcDNA5/FRT重组质粒的293T细胞上清中特异的E蛋白条带,但经基因改造后的重组质粒D3YWJprME397-pcDNA5/FRT和D3YWJprME397J-pcDNA5/FRT的细胞上清中均可检测到登革3型病毒特异的E蛋白条带。故转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革3型病毒prM/E蛋白,但登革病毒E蛋白羧基末端的20%影响其蛋白的分泌。在293T细胞中大量转染D3YWJprME397J-pcDNA5/FRT,将上清浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化的D3YWVLPs。三、D3YWVLPs免疫原性研究将4～6周龄的BALB/c雌性小鼠随机分为5组(5只／组),即登革3型义乌流行株病毒样颗粒组(YW-VLPs),登革3型义乌流行株灭活病毒组(YW-V),登革3型国际标准株病毒样颗粒组(H87-VLPs),登革3型国际标准株灭活病毒组(H87-V),PBS对照组(PBS)。将抗原及PBS分别与等体积佐剂充分乳化,于第0,14,28天腹腔接种,免疫剂量为100μg/只。体液免疫及细胞免疫检测结果,VLPs刺激机体产生的免疫反应,但VLPs组与灭活病毒组免疫效果无统计学差异(p0.05),义乌流行株与国际标准株间无论在VLPs组还是灭活病毒组免疫效果均无统计学差异(p0.05)。义乌流行株VLPs可刺激小鼠产生DENV1～4EⅢ蛋白的IgG抗体,但仅具有中和登革3型病毒的活性。关键词：登革病毒论文义乌流行株论文病毒样颗粒论文生物学特性论文
英文缩略词表5-6
中文摘要6-9
Abstract9-12
前言12-14
2009年登革3型病毒义乌流行株系统进化分析14-36
实验14-15
实验方法15-20
实验结果20-27
讨论27-28
单元小结28-29