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探究长牡蛎(Crassostreagigas)Caspase基因克隆、重组和表达查抄袭率

收藏本文 2024-02-04 点赞:7510 浏览:20082 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:本论文以长牡蛎为探讨对象,利用长牡蛎幼虫cDNA文库中的EST信息,克隆到长牡蛎凋亡相关Caspase(CgCASP1),通过RealtimePCR浅析了该基因在各幼虫阶段的表达特点以及在成体中的组织分布。在原代细胞水平上检测了CgCASP1基因随细胞培养时间增加的表达变化;利用PDTC及H_2O_2对原代细胞进行刺激诱导凋亡后,浅析了CgCASP1和Repsh基因mRNA及蛋白水平的表达量变化;构建了体外重组表达载体,并对重组蛋白进行了分离和纯化与活性检测。主要实验的探讨结果如下:利用EST提示信息成功克隆了全长为3613bp的CgCASP1基因cDNA序列,其中包含473bp5’UTR及1526bp3’UTR,开放阅读框长1626bp,编码541个氨基酸。该基因编码的蛋白包含caspase家族经典的保守域P20大亚基和P10小亚基,其中五肽保守序列QACRS突变为QACRG。探讨发现了长牡蛎CgCASP1的特有片段,并在cDNA及基因组水平上分别进行了验证;通过realtimePCR浅析,发现CgCASP1基因在各幼虫时期均有表达,D型幼虫期最高;而成体中鳃的表达量最高,外套膜与肝胰脏中表达量最低。探讨发现随着长牡蛎原代细胞培养时间的增加,CgCASP1基因的表达量相应上调;对原代细胞进行H_2O_2刺激诱导凋亡后Repsh基因mRNA表达并无差别,CgCASP1基因表达量显著上调,提示该基因与细胞凋亡相关;PDTC刺激诱导凋亡后下调了Repsh基因mRNA表达量,CgCASP1基因没有显著的表达差别;且PDTC刺激后胞质及胞核内的Repsh蛋白量均下调,而H_2O_2刺激后对Repsh蛋白无显著作用。在克隆得到CgCASP1基因cDNA全长的基础上,分别构建原核重组表达载体CgCASPl-pEASY-E2和真核重组表达载体CgCASPl-pT7CFE1-Chis进行体外表达:在原核表达系统中得到了约70kD大小的重组蛋白;在真核表达系统中检测了重组蛋白的活性。本论文通过对长牡蛎凋亡相关基因CgCASPl基因的克隆,初步浅析了该基因的序列特点和与细胞凋亡的相关性,可以为深入了解软体动物凋亡机制,以及个体发育、形态发生及内源性免疫方面增添新的认识。关键词:长牡蛎论文Caspase论文细胞凋亡论文RealtimePCR论文细胞培养论文体外重组表达论文

    致谢4-5

    摘要5-6

    Abstract6-9

    1 绪论9-24

    1.1 引言9

    1.2 长牡蛎(Crassostreagigas)9-11

    1.3 Caspase家族11-16

    1.3.1 Caspase结构与分类11-13

    1.3.2 Caspase活化13-14

    1.3.3 Caspase家族功能14-15

    1.3.4 Caspase的作用底物及抑制剂15-16

    1.3.5 软体动物中Caspase的探讨进展16

    1.4 细胞凋亡16-23

    1.4.1 凋亡细胞形态特点16-18

    1.4.2 Caspase介导的细胞凋亡途径18-21

    1.4.3 H_2O_2及PDTC诱导凋亡机制21

    1.4.4 细胞凋亡功能21-22

    1.4.5 细胞凋亡的检测策略22-23

    1.5 探讨的目的和作用23-24

    2 CgCASPl基因全长的克隆24-33

    2.1 材料策略24-29

    2.1.1 实验材料24-25

    2.1.2 实验策略25-29

    2.2 结果29-32

    2.2.1 CgCASPl基因克隆及序列浅析29-31

    2.2.2 CgCASPl基因与其他物种Caspase比较31-32

    2.3 讨论32-33

    3 CgCASPl基因验证及Real-timePCR表达浅析33-39

    3.1 材料策略33-36

    3.1.1 实验材料33-34

    3.1.2 实验策略34-36

    3.2 结果36-38

    3.2.1 CgCASPl基因在cDNA水平上的验证36-37

    3.2.2 Caspase片段在基因组水平上的验证37

    3.2.3 不同组织与各幼虫时期CgCASPl基因的表达分布37-38

    3.3 讨论38-39

    4 CgCASPl基因与凋亡相关性的初步探讨39-46

    4.1 材料策略39-42

    4.1.1 实验材料39-40

    4.1.2 实验策略40-42

    4.2 结果42-44

    4.2.1 原代细胞中Caspase表达浅析42

    4.2.2 PDTC、H_2O_2刺激后CgCASPl和repsh基因的表达变化42-43

    4.2.3 PDTC、H_2O_2刺激后Repsh蛋白的表达变化43-44

    4.3 讨论44-46

    5 CgCASPl 重组蛋白的体外表达46-54

    5.1 材料策略46-51

    5.1.1 实验材料46-48

    5.1.2 实验策略48-51

    5.2 结果51-52

    5.2.1 CgCASPl重组蛋白的原核表达51-52

    5.2.2 CgCASPl重组蛋白的真核表达52

    5.3 讨论52-54

    结论54-55

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