摘要:GABA_B受体属于G蛋白偶联受体C家族成员之一,是抑制性神经递质GABA的代谢性受体,介导缓慢而且持久的神经突触活动。功能性的GABA_B受体是由GB1亚基和GB2亚基组成的跨膜异源二聚体。之前的探讨表明,GABA_B受体的脱敏作用和其它GPCR受体是不同的,它在细胞膜表面的表达是非常稳定的,未激活的GABA_B受体体现出快速的组成性内吞作用和再循环(recycpng)到细胞膜,而配体(如GABA,baclofen)激活GABA_B受体后会加速它的内吞作用和再循环。在神经突触上,快速的内吞和再循环保证了GABA_B受体迅速以脱敏状态恢复到功能状态,以而行使受体功能,抑制神经元过多的兴奋性突触传递,然而这一现象的分子机制还不清楚。GABA_B受体的胞内区C末端含有结合信号分子的motif或domain,结合到受体C末端的激酶或者其它蛋白起到调控GABA_B受体活性的作用。在本探讨中,我们首先利用表达GABA_B受体C末端的融合蛋白GST-GB1-C或GST-GB2-C作为诱饵,在体外培养的小脑颗粒神经元细胞中,找寻结合到GABA_B受体C末端的新的蛋白。通过银染,质谱浅析,免疫印迹实验发现Ras家族成员的小G蛋白Rap1特异性的结合到GABA_B受体GB1亚基的C末端,而且只有活性的Rap1GTP才能直接结合GB1亚基C末端,但不结合GB2亚基的C末端。同时我们证明了GABA_B受体的激活会特异性的介导持续性的长时间的Rap1激活,受体激活Rap1是通过Gi/o信号的αlpha亚基通路传递的,而且Rap1GAPII参与这一历程。进一步我们证明了GABA_B受体的激活会导致Rap1以细胞质区域迁移到细胞膜区域,突变体依赖的GST Pull-down实验和化学合成短肽实验证明了活性Rap1结合在GABA_B受体的GB1亚基的C末端氨基酸954-960区域(RVHLLYK),其中带正电荷的氨基酸R954和K960分别与活性Rap1效应子(effector)结合区域中带负电荷的D33和E37有静电作用。接下来我们发现短肽Pep (DGSRVHLLYK)可以在细胞内特异性的阻断活性Rap1与GB1亚基的C末端相互作用,体现出减少GABA_B受体介导的IP3积累。同时我们发现了短肽Pep阻断活性Rap1与GB1亚基的C末端相互作用后,会导致GABA_B受体在细胞膜上的数目减少,过表达Rap1GAPII也会降低GABA_B受体在细胞膜上的数目。利用缺失结合Rap1区域的ΔS953-GB1探讨发现,配体激活ΔS953-GB1后,直接导致ΔS953-GB1在细胞膜上的数目减少,然而配体并不减少野生型GB1亚基在膜表面的数目。我们发现GABA_B受体的激活会导致持续性的Rap1激活,而且活性的Rap1会结合到GABA_B受体的GB1亚基的胞内区C末端,以而起到制约GABA_B受体在细胞膜表面活性稳定的作用。这表明GABA_B受体介导的Rap1激活对于GABA_B受体自身而言是一种正反馈调控机制。关键词:GABA_B受体论文Rap1论文膜表面受体活性论文相互作用论文正反馈调控论文
摘要4-6
Abstract6-10
1 绪论10-29
1.1 GABA_B受体结构与功能探讨进展10-19
1.2 小G蛋白Rap1 探讨进展19-27
1.3 本探讨目的及作用27-29
2 实验策略29-37
2.1 原代小鼠小脑颗粒神经元的培养与药物刺激29-30
2.2 细胞转染技术30
2.3 GST Pull-Down Assay与Rap1 活性检测技术30-31
2.4 银染技术与LC-MS质谱浅析31
2.5 免疫印迹(Western Blotting)31-32
2.6 基因突变与RT-PCR浅析技术32-34
2.7 ELISA34
2.8 H3-IP3 产量测定34-35
2.9 免疫荧光技术35
2.10 流式细胞检测技术35-37
3 GABA_B受体介导的Rap1 信号机制和功能探讨37-96
3.1 摘要37-38
3.2 前言38-39
3.3 实验仪器39-40
3.4 实验材料与策略40-52
3.5 实验结果52-91
3.6 讨论91-96
总结与展望96-98
致谢98-99