粘附F18ab~+大肠杆菌hcp基因缺失株构建与其对重要毒力因子分泌功能影响

摘要：[探讨背景]产志贺毒素大肠杆菌(STEC) F18ab菌株是引起断奶仔猪腹泻和水肿病的重要致病菌,长期以来给我国的养猪业带来了巨大损失,掌握该致病菌的致病机制达到防控疾病发生成为科研工作者长期的目标。该菌强大的致病力主要源自于它的毒力因子,包括Ⅰ型菌毛、F18ab菌毛、鞭毛、AIDA(adhesin involved in diffuse adherence)、stx2e等。而这些毒力因子有的分布在菌体的外表面,起着粘附宿主细胞的作用,有的分泌在菌体外环境中,破坏宿主细胞,这些毒力因子都需要细菌本身的分泌途径在它们合成和表达完成以后运输到菌体外,这个分泌的历程在很大程度上影响了细菌的致病力。[实验目的]探讨F18ab大肠杆菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)中hcp基因在其重要毒力因子分泌历程中的作用,为预防和制约大肠杆菌病寻找新的切入点。[实验策略]基于hcp基因的已知序列,利用λ噬菌体Red重组系统敲除Ⅵ型分泌系统(T6SS) hcp基因。首先合成一对引物(引物与E.cop菌株的hcp基因序列5'端同源)检测实验菌株(E.cop F18ab)是否含有hcp基因,获得其基因序列。再根据实验菌株的hcp基因序列合成一对引物(引物5'端与hcp基因同源,3'端与氯霉素抗性基因cat同源)用来获得带氯霉素抗性基因的PCR产物,然后转化至大肠杆菌F18ab菌株中,在Red重组系统表达重组酶的帮助下,氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的hcp基因同源序列与大肠杆菌染色体上的hcp基因发生同源重组,通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过第二次重组去除抗性基因,结合PCR扩增和测序结果,证明hcp基因缺失株F18ab△hcp的正确构建。然后比较浅析该突变缺失株与野生株的生物学特性(主要包括细菌的生长情况,生化反应,运动能力,体外IPEC-J2细胞粘附和侵袭能力,小鼠排毒带菌量变化以及对Vero细胞的杀伤力能等几个方面)。[实验结果]同F18ab野生株相比,hcp突变株的运动能力下降了18.8%,对猪小肠上皮细胞的体外粘附和侵袭能力分别下调了40%和28%；小鼠排毒带菌试验结果显示攻毒24h后△hcp突变株的排毒量增加,表明突变株在小鼠体内粘附能力下降；并且细胞毒性试验结果表明,△hcp突变株实验组的Vero细胞存活量是野生株实验组的7倍；但是,通过Real Time-PCR试验检测浅析△hcp突变株的Ⅰ型菌毛(fimH)、F18ab菌毛(fedF)、鞭毛(fpC), AIDA(adhesin involved in diffuse adherence)、Stx2e这五个重要毒力因子的表达量变化,发现与野生型菌株之间无差别。综上所述,hcq,基因不影响该菌株以上五个重要毒力因子的表达,但是有可能涉及到它们的分泌历程,尤其是Stx2e蛋白的分泌,所以引起了这些生物学特性的减弱或丢失。关键词：λRed重组系统论文Ⅵ型分泌系统论文hcp基因突变论文粘附论文侵袭论文Vero细胞论文毒力因子论文stx2e论文

摘要2-4

Abstract4-6

目录6-9

符号说明9-10

上篇 文献综述10-20

第一章 细菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)探讨进展10-17

1.1 T6SS基因的发现历程10-11

1.2 T6SS基因11-13

1.3 T6SS蛋白组成13-16

1.4 T6SS装置的模型及其工作原理16

1.5 对T6SS探讨的展望16-17

同源重组PCR引物的设计24

2.2.4 融合PCR产物的制备和纯化24-25

2.2.5 感受态细胞的制备及转化25-26

2.2.5.1 感受态细胞的制备25

2.2.5.2 质粒pKD46的转化25

2.2.5.3 Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备25-26

2.2.6 同源臂cat基因PCR产物电转化26

2.2.7 质粒pKD46的消除26

2.2.8 一次同源重组菌△hcp::Cat的PCR鉴定26-27

2.2.9 FLP位点专一性重组27

2.2.10 二次重组菌△hcp的鉴定27-28

2.3 结果28-29

2.3.1 野生株hcp基因的鉴定28

2.3.2 融合PCR产物的制备28

2.3.3 第一次同源重组菌△hcp：：Cat的PCR鉴定28-29

2.3.4 第二次重组菌△hcp的鉴定29

2.3.5 鉴定引物扩增△hcp菌株染色体上序列浅析29

2.4 讨论29-30