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摘要：目的本课题通过对临诊乙型肝炎病毒（Hepatisis B Virus, HBV）感染阳性患者所携带HBV基因组DNA（Genomic DNA, gDNA）的反转录酶（Reverse Transcriptase,RT）区进行调查，以期发现单个或多个有义变异位点，以而推断其变异与抗HBV药物的相关性，为发现HBV新的耐药位点及临床抗HBV用药提供新的素材和论述参考；选取典型变异样本的HBV gDNA，构建其RT活性区的重组克隆，转染细胞并经间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测其表达活性，为构建其永久表达细胞系做准备，同时为探讨HBV变异与耐药性奠定基础。策略1.临床标本收集选取以2011年4月至2011年12月在泰安八十八医院用核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）大三阳患者，取其全血并分离血清，-80℃标记冻存。2.CHB大三阳血清中HBV gDNA的提取采取BIOMIGA公司血液基因组DNA提取试剂盒以保存的血清中分离、纯化HBV gDNA。3.HBV全长gDNA的扩增取经PCR扩增HBV S基因片段为阳性的核酸样本，用互为重叠的两对引物经PCR分两段扩增HBV DNA全长基因（分为f1、f2两部分）。4.HBV gDNA的克隆和测序将扩增出的f1、f2片段PCR产物分别与原核载体pMD18T vecter连接，分别命名为T-f1、T-f2，在固体培养皿上长出的优势抗性菌落，经初步特异性检测为阳性的克隆菌落后测序，并对测序结果进行拼接，比对，校正，浅析HBV基因核苷酸差别、变异类型。5.重组质粒pc-RT的构建选取一例HBV RT区发生经典变异的样本，并以该样本T-f1、T-f2为模板，设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物，扩增回收RT片段，与克隆载体pMD18Tsimple vecter连接，测序验证后，将RT片段酶切回收，亚克隆入pcDNA3.1(-)中，构建真核表达重组质粒pc-RT。6.筛选CHO细胞对新霉素的敏感浓度用200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml6个新霉素浓度梯度作用于CHO细胞，镜下观察选择出在10-14天内使细胞全部死亡的最低新霉素浓度。7.HBV RT区在CHO细胞中的瞬时表达将重组质粒pc-RT在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，6小时后加入带有新霉素筛选浓度的培养液，24小时后检测RT区在CHO细胞中的表达。8.IFA及Western blot检测表达情况对转染的细胞用大三阳阳性血清介导的IFA和Western blot检测HBV RT区蛋白的表达。结果1.HBV DNA基因全长的测序比对在P区基因的反转录酶区，有几处需关注的变异情况（两例及以上出现的变异），可能为引起CHB患者耐药变异的位点。2.CHO细胞对新霉素敏感浓度的确定经浓度梯度递倍稀释等筛选，最后确定CHO细胞对新霉素的最佳筛选浓度为700ug/ml。3.IFA实验及Western blot实验检测HBV RT区表达结果IFA实验结果显示，在荧光显微镜下，阳性表达细胞在70%以上。Western Blot实验结果显示，HBV RT区蛋白在CHO细胞中成功表达。结论1.上面陈述的慢性乙型肝炎患者运用核苷（酸）类药物治疗历程中，P区出现几处需关注的变异情况，有5例样本与已报道的HBV RT区经典变异位点相同，有6处氨基酸变异与已证实的位点有所不同，初步发现了与HBV耐药有关新的潜在变异位点。2.成功将HBV RT区亚克隆入pcDNA3.1(-),构建了真核表达重组质粒pc-RT。3.HBV RT区真核细胞中成功表达，为构建该HBV RT区段永久表达性细胞系及进一步探讨其分子机制和筛选新的治疗药物奠定实验基础。关键词：HBV论文RT区论文克隆测序论文耐药性变异论文表达论文细胞系论文
中文摘要5-8
ABSTRACT8-11
符号说明11-12
前言12-14
第一部分14-30
材料与策略15-23
结果23-27
小结27-28
附图28-30
第二部分30-51
材料与策略31-46
结果46-48
小结48-49
附图49-51
实验讨论51-55
结论55-56
附录56-75