摘要：α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以水解人们日常饮食中常见的黄酮苷类化合物,广泛分布于自然界的细菌和真菌中。α-L-鼠李糖苷酶在实际工艺中具有潜在的应用价值。本论文选用Enterococcus durans作为发酵菌种,对α-L-鼠李糖苷酶的活性条件测定了研究,讨论了从发酵液中分离提纯α-L-鼠李糖苷酶的主要,并研究了纯化后的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质。主要实验结果如下:(1)确定了α-L-鼠李糖苷酶的活性测定条件:在10 mL的比色管中,加入2 mL pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液后,再加入0.1 mL酶液或粗酶液,置于45℃水浴锅中预热5 min,加入0.2mL已经预热的对硝基-α-L-鼠李糖苷作为底物,反应4 min,反映结束后立即取出并加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3终止反应,冷却至室温后,于400 nm波长处测定吸光值。(2)单因素实验以及正交试验对Enterococcus durans产α-L-鼠李糖苷酶的发酵条件了优化,基础产酶培养基的最佳配比为:蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2 mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3 mmol/L;相应的产酶发酵条件为:培养基的初始pH为7.0,培养温度为34℃,发酵周期为4 d,摇床转速为180 r/min,250 mL三角瓶装液量为70 mL,接种量为3%。(3)α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化:①实验确定了硫酸铵分级沉淀浓度范围为50~80%;②硫酸铵盐析后的沉淀用20 mL 4℃蒸馏水溶解后,装入透析袋,置于4℃蒸馏水中透析约30h后,浓缩至5mL;③DEAE-纤维素52阴离子交换层析纯化α-L-鼠李糖苷酶:平衡缓冲液的pH为5.0,KCl梯度线性化洗脱浓度为0.2～0.6 mol/L,在KCl浓度低于0.2 mol/L或高于0.6 mol/L时,基本蛋白峰洗出。洗脱流速为0.6 mL/min,15 min一管,发现的第12管中酶活最高,蛋白峰目的酶活性,为杂蛋白峰,KCl浓度为0.3～0.5 mol/L时,即可把α-L-鼠李糖苷酶洗脱下来。④Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化α-L-鼠李糖苷酶:用pH 5.0、浓度0.02 mol/L的醋酸缓冲液洗脱,流速为0.4 mL/min,15 min一管,三个蛋白峰,个为峰为峰。(4)对盐析后和凝胶层析纯化后的酶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为6%。结果,盐析并透析后的酶液仍含有杂蛋白,经过离子交换层析和凝胶层析后,SDA-PAGE凝胶电泳单条带,酶蛋白已经纯化,并确定酶蛋白的分子量约为90 KDa。(5)纯化后的α-L-鼠李糖苷酶经酶学性质研究发现耐酸性较强并具有较强的耐热性;K~+、Mg~(2+)对α-L-鼠李糖苷酶具有的激活作用,而Ca~(2+)、Fe~(2+)则对酶具有的抑制作用。多数有机溶剂对α-L-鼠李糖苷酶均有一定的抑制作用,其中丙酮对α-L-鼠李糖苷酶的抑制作用最强。以对硝基-α‐L‐鼠李糖苷为底物的动力学常数为:Vmax﹦16.13 U/L,Km﹦4.58 mmol/L。关键词：α-L-鼠李糖苷酶论文耐久肠球菌论文条件优化论文分离纯化论文酶学性质论文
摘要7-9
ABSTRACT9-11
第1章 绪论11-21
1.1 糖苷类化合物与糖苷酶11-12
1.1.1 糖苷类化合物11-12
1.1.2 糖苷酶12
1.2 α-L-鼠李糖苷酶12-17
1.2.1 α-L-鼠李糖苷酶的来源12-13
1.2.2 α-L-鼠李糖苷酶的性质13-16
1.2.3 应用16-17
1.3 肠球菌17-19
1.3.1 肠球菌的生物学特性17-18
1.3.2 肠球菌的分类18
1.3.3 肠球菌的致病性18
1.3.4 肠球菌的耐药性18-19
1.4 酶的分离纯化19-20
1.4.1 纯化方案的设计19
1.4.2 主要的分离方法19-20
1.5 本课题研究20-21
第2章 肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶液体发酵培养基的优化21-45
2.1 与方法23-26
2.1.1 23-25
2.1.2 方法25-26
2.2 结果与讨论26-42
2.2.1 耐久肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶活性测定条件的研究26-32
2.2.2 单因素实验32-35
2.2.3 正交试验35-36
2.2.4 最佳发酵培养基的验证36
2.2.5 培养条件优化36-42
2.3 小结42-45
第3章 肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化45-59
3.1 与方法49-54
3.1.1 49-51
3.1.2 方法51-54
3.2 结果与讨论54-57
3.2.1 制定盐析分级沉淀54-55
3.2.2 透析55
3.2.3 离子交换层析55-56
3.2.4 凝胶层析56
3.2.5 纯化收得率总结56-57
3.3 小结57-59
第4章 肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶的性质研究59-71
4.1 与方法60-64
4.1.1 60-61
4.1.2 方法61-64
4.2 结果与讨论64-70
4.2.1 SDS-凝胶电泳确定α-L-鼠李糖苷酶的纯度及分子量64-66
4.2.2 α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性66
4.2.3 α-L-鼠李糖苷酶的pH 稳定性66-67
4.2.4 金属离子对α-L-鼠李糖苷酶的影响67-68
4.2.5 有机溶剂对α-L-鼠李糖苷酶的影响68-69
4.2.6 α-L-鼠李糖苷酶的动力学常数69-70
4.3 小结70-71
第5章 与展望71-73
5.1 71-72
5.2 展望72-73
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