致鹅败血症粪肠球菌鉴定与溶血素激活因子原核表达-turnitin论文查重

摘要：1、对从通辽某祖代和父母代鹅场主要表现昏睡、持续性下痢、跛行和瘫痪症状,呈现急性败血症病理特征的20～30日龄仔鹅心脏、肝脏、淋巴结和脑组织液等组织分离的4株细菌,形态学观察、生长耐受试验、毒力因子表型试验、生化试验等表型特征鉴定,16SrDNA检测和系统进化分析。结果接触媒试验和发酵葡萄糖产气试验阴性、吡咯烷酮芳胺酶试验和胆汁-七叶苷试验阳性,在pH9.6、10℃、45℃、60℃30min、6.5%NaCl等条件下能生长,动力试验阳性。甘露醇、山梨醇、山梨糖等糖(醇)类发酵试验分别为阳性、阳性和阴性,精氨酸双水解酶试验阳性。亚碲酸盐和丙酮酸盐利用试验阳性,依罗霉素敏感试验耐药,葡萄糖吡喃糖苷产酸试验阴性。乳糖、水杨素发酵试验阳性,蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、木糖发酵试验为阴性。4株分离菌与参考菌株ATCC29212及国内分离的典型菌株GU385352等粪肠球菌菌株16SrDNA的同源性均在99.0%以上。致病性试验小鼠半数致死量为1011.2。确定本次从鹅体内分离的4株细菌均为中等致病性粪肠球菌,命名为TLME3株。2、为探讨致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子(Cytolysin Activator, CylA)的变异性,研究其功能变化与基因变异的关系。本试验NCBI数据库中Genbank上粪肠球菌溶血素激活因子基因序列设计特异性引物,用PCR扩增,连接到pMD18-T载体上,应用PCR及酶切方法检测出阳性克隆并序列测定。结果TLME3的溶血素激活因子基因序列与Genbank上L37110、AF329367、AF454824、AY032999的溶血素激活因子基因序列同源性均在99.4%以上。与国内猪源分离株HE1、HE9、HE12、HE30该基因的同源性在99.0%以上,其中与HE9的同源性最高为99.8%。在50bp、385bp、484bp、666bp等处有变异。结果,本试验成功克隆致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因,该基因保守,与L37110等菌株同源,仅个别核苷酸处有变异。3、为给研究致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子的功能奠定基础。将TLME3溶血素激活因子基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-CylA重组质粒,经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,用IPTG诱导表达。用High-Affinity GST Resin纯化表达的融合蛋白,并SDS-PAGE分离和Western-Blot检测分析。结果的溶血素激活因子基因片段为1239bp,与Genbank上L37110等菌株的溶血素激活因子基因序列同源性均在99.0%以上。SDS-PAGE、Western-Blot检测蛋白表达带分子量为65.9kD,是溶血素激活因子基因表达产物。结果,在BL21 (DE3)中高效表达了TLME3株溶血素激活因子。关键词：粪肠球菌论文鹅败血症论文表型特征鉴定论文16SrDNA检测论文致病性论文溶血素激活因子论文克隆论文原核表达论文

摘要3-5

Abstract5-11

插图和附表清单11-13

缩略语表13-15

引言15-16

篇文献综述16-26

章粪肠球菌概述16-26

1.1 粪肠球菌分类16

1.2 粪肠球菌形态及特征16-17

1.3 抵抗力及对药物敏感性17

1.4 诊断特征及致病性17-18

1.5 禽类感染粪肠球菌研究进展18-19

1.6 粪肠球菌鉴定方法研究进展19-20

1.7 粪肠球菌毒力岛研究进展20-23

1.8 粪肠球菌溶血素研究进展23-26

篇研究内容26-73

章致鹅败血症粪肠球菌的分离鉴定26-49

1 和方法26-36

1.1 试验26-27

1.1.1 病料采集26

1.1.2 试验菌株26

1.1.3 试验动物26

1.1.4 培养基26

1.1.5 分子生物学试剂26-27

1.1.6 引物27

1.2 主要仪器27

1.3 试验方法27-36

1.3.1 表型特征鉴定28-29

1.3.1.1 病原菌的分离筛选28

1.3.1.2 生物学特性观察28-29

1.3.2 16SrDNA鉴定29-35

1.3.2.1 分离菌总DNA提取(模板的制备)29-30

1.3.2.2 16SrDNA的扩增30-31

1.3.2.3 16SrDNA重组质粒的构建31-34

1.3.2.4 16SrDNA序列测定及分析34-35

1.3.3 致病性试验35-36

1.3.4 药敏试验36

2 试验结果36-46

2.1 表型特征鉴定结果36-41

2.1.1 病原菌的分离筛选36-37

2.1.2 生物学特性观察结果37-40

2.1.2.1 形态学观察结果37

2.1.2.2 属的区别、分群和种的鉴定结果37-40

2.1.3 毒力因子表型试验结果40-41

2.2 16SrDNA鉴定结果41-44

2.2.1 16SrDN段的扩增结果41

2.2.2 pMD18T-16SrDNA重组质粒PCR鉴定结果41

2.2.3 pMD18T-16SrDNA重组质粒双酶切鉴定结果41-42

2.2.4 16SrDN段测序结果42-43

2.2.5 16SrDNA同源性分析结果43-44

2.3 致病力试验结果44-45

2.4 药敏试验结果45-46

3 讨论46-48

3.146-47

3.247-48

3.348

3.448

4 48-49

章致鹅败血症粪肠球菌溶血素Cy1A基因克隆及序列分析49-59

1 和方法49-55

1.1 试验49

1.1.1 菌株49

1.1.2 主要试剂49

1.1.3 引物49

1.2 主要仪器49-50

1.3 试验方法50-55

1.3.1 模板的制备50

1.3.2 Cy1A基因扩增和序列测定50-51

1.3.2.1 PCR反应体系和条件50-51

1.3.2.2 PCR产物的纯化回收51

1.3.3 Cy1A重组质粒的构建51-55

1.3.3.1 PCR产物与T载体的连接51-52

1.3.3.2 感受态细胞的制备52

1.3.3.3 重组质粒的转化52

1.3.3.4 重组质粒的小量提取52

1.3.3.5 重组质粒鉴定52-53

1.3.3.6 溶血素Cy1A基因序列测定及分析53-55

2 试验结果55-58

2.1 溶血素Cy1A基因扩增结果55

2.2 重组质粒鉴定结果55-56

2.2.1 重组质粒PCR鉴定结果55

2.2.2 重组质粒双酶切鉴定结果55-56

2.3 溶血素Cy1A基因序列测定及分析结果56-58

2.3.1 溶血素Cy1段的纯化回收结果56

2.3.2 溶血素Cy1A基因序列测定结果56-57

2.3.3 溶血素Cy1A基因序列分析结果57-58

2.3.3.1 溶血素Cy1A基因序列同源性分析结果57

2.3.3.2 溶血素Cy1A基因序列进化分析结果57-58

3 讨论58

3.158

3.258

3.358

4 58-59

章致鹅败血症粪肠球菌溶血素Cy1A基因的原核表达59-73

1 和方法59-67

1.1 试验59-60

1.1.1 菌株59

1.1.2 主要试剂59-60

1.1.3 引物60

1.2 主要仪器60

1.3 试验方法60-67

1.3.1 Cy1A基因扩增和序列测定60

1.3.2 Cy1A重组蛋白原核表达载体的构建60-62

1.3.2.1 Cy1A目的片段的61

1.3.2.2 表达载体的酶切61-62

1.3.2.3 目的基因片段与表达载体的连接62

1.3.3 Cy1A重组蛋白原核表达载体质粒的转化62-63

1.3.4 Cy1A重组质粒鉴定63

1.3.5 Cy1A重组质粒的诱导表达63-65

1.3.5.1 重组质粒的转化和阳性克隆菌的筛选63

1.3.5.2 IPTG最佳诱导时间的确定63-64

1.3.5.3 IPTG最佳诱导浓度的确定64

1.3.5.4 重组蛋白的SDS-PAGE电泳分离64-65

1.3.6 Cy1A重组蛋白的纯化65-66

1.3.6.1 蛋白样品的准备65-66

1.3.6.2 垫料的准备66

1.3.6.3 蛋白的层析纯化66

1.3.7 Western Blot分析66-67

2 结果67-71

2.1 Cy1A序列测定及分析结果67-69

2.1.1 Cy1A序列测定结果67

2.1.2 Cy1A序列分析结果67-69

2.2 pET28a(+)-Cy1A重组质粒的PCR鉴定结果69-70

2.3 pET28a(+)-Cy1A重组质粒的酶切鉴定结果70

2.4 IPTG最佳诱导时间结果70

2.5 IPTG最佳诱导浓度结果70-71

2.6 蛋白纯化结果71

2.7 Westen Blot分析结果71

3 讨论71-72

3.171

3.271-72

3.372

3.472

3.572

4 72-73

致鹅败血症粪肠球菌鉴定与溶血素激活因子原核表达

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