本站原创
摘要：茶多酚是茶树[Camelpa sinensis(L.)O.Kuntze]中主要的类黄酮次生代谢产物,具有重要的生理生化作用。涉及类黄酮生物合成的基因由两类：编码相关合成酶的结构基因和编码转录因子的调控基因。转录因子具有调控结构基因表达的功能。MYB转录因子参与调控苯丙烷类次生代谢途径,是植物中最大的转录因子家族之一为了明确MYB转录因子在茶树类黄酮物质合成中的作用,本探讨克隆了茶树中3个MYB转录因子,对其进行了生物信息学浅析；利用实时荧光定量技术,浅析了3个MYB基因的差别表达；构建了原核表达载体,表达了目的蛋白；构建了表达载体,侵染拟南芥和烟草,进行3个MYB基因功能的初步浅析。主要探讨结果如下：1.以NCBI.安徽农业大学茶树转录组中筛选得到一些可能参与酚类物质合成调控的候选cDNA,利用RACE技术,克隆得到茶树CsMYB4-5、CsMYB4-6和CsMYB4-7基因全长。2.生物信息学浅析结果：蛋白理化性质浅析显示CsMYB4-5、CsMYB4-6和CsMYB4-7蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白；一级结构浅析显示3个基因都定位在细胞核且都不有着信号肽：二级结构浅析表明,3个蛋白均以a螺旋为主并通过长链转角连接起来,符合MYB蛋白折叠成螺旋-转角-螺旋(hepx-turn-hepx HTH)的特点结构；结构浅析表明,3个蛋白质的结构都很简单,由6个a-螺旋条带简单的缠绕在无规则卷曲线上；分子系统进化浅析表明CsMYB4-5与金鱼草中的AmMYB330一致性为48.45%,CsMYB4-6与金鱼草中的AmMYB308一致性为69.80%,与AtMYB4的一致性为62.41%；CsMYB4-7与柿子中的DkMYB4(?)致性为64.12%,CsMYB4-5、CsMYB4-6与拟南芥第四亚组的AtMYB3、AtMYB4、 AtMYB7及AtMYB32在同一进化分支。且比对结果显示CsMYB4-5、CsMYB4-6具有C1和EAR基序。3.利用实时荧光定量PCR技术检测了三个基因在茶树不同器官、不同发育时期叶片组织中的表达水平,结果显示,CsMYB4-5和CsMYB4-6(?)巧个基因均在根中高表达,在茎中低表达：但是随着叶片伸展发育,两个基因的表达走势并不完全相同。而CsMYB4-7在根中低表达,在茎中高表达。另外,还检测了三个基因在植物激素GA和ABA和伤害处理1小时和48小时后的表达水平,结果表明,只有CsMYB4-7对GA和ABA和伤害处理产生了2倍以上的表达差别,其余两个基因变化不大。4.构建了pET32a+-CsMYB4-5和pET32a+-CsMYB4-6重组质粒,转化了表达宿主菌rosetta(DE3),用IPTG诱导表达,得到目的蛋白条带。5.构建了pCB2004-CsMYB4-5、pCB2004-CsMYB4-6和pCB2004-CsMYB4-7载体,并利用点击法转入了C58C1和EHA105农杆菌；侵染了拟菌芥pap1-D突变体和烟草。关键词：茶树论文MYB转录因子论文基因克隆论文qRT-PCR论文原核表达论文异源真核表达论文
摘要3-5
Abstract5-7
目录7-9
1 文献综述9-16
1.1 茶树类黄酮代谢途径探讨进展9-11
1.2 MYB转录因子探讨进展11-16
1.2.1 MYB转录因子的结构特点11-12
1.2.2 MYB的作用机理12-13
1.2.3 MYB转录因子在类黄酮代谢中的作用13-14
1.2.4 拟南芥R2R3-MYB家族的功能进化浅析14-16
2 引言16-18
2.1 探讨作用16
2.2 技术路线16-17
2.3 探讨内容17-18
3 材料和策略18-33
3.1 实验材料18
3.2 仪器与试剂18-20
3.2.1 主要药品和试剂18
3.2.2 主要仪器18
3.2.3 主要试剂配方18-20
3.3 试验策略20-33
3.3.1 基因克隆20-27
3.3.2 生物信息学浅析27
3.3.3 实时荧光定量PCR27-28
3.3.4 原核表达28-29
3.3.5 转化拟南芥和烟草29-33
4 结果和浅析33-47
4.1 RNA提取与质量检测33
4.2 MYB基因的扩增33-34
4.3 生物信息学浅析34-41
4.3.1 基因编码氨基酸的理化性质34-36
4.3.2 蛋白质的一级结构浅析36-37
4.3.3 蛋白质的二级结构浅析37-39
4.3.4 蛋白质的结构浅析39
4.3.5 分子系统进化浅析39-41
4.4 实时荧光定量PCR41-43
4.5 原核表达43-44
4.6 转化拟南芥和烟草44-47
4.6.1 载体构建44-45
4.6.2 侵染后的拟南芥和烟草45-47
5 讨论47-50
6 结论50-51