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摘要：血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factors receptors PDGFRs)是有着于细胞膜表面的酪氨酸激酶，特异性应答血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowth factors PDGFs)的一类受体。PDGFRs的结构特点是在胞外配位子结合区域有5个免疫球蛋白结构域，一个跨膜序列，胞内有一个酪氨酸激酶结构域[1]。二聚化的PDGFs结合到受体上并促使PDGFRs形成二聚体，胞质结构域内的酪氨酸残疾发生自身磷酸化，通路被激活[2,3]。PDGFRs包括两种形式，即PDGFR-α与PDGFR-β[4]。PDGFRs可以激活下游三条主要通路：分裂素活化蛋白激酶(themitogen-activated protein kinase MAPK)/胞外信号调控激酶(extracellularsignal-regulated kinase Erk)通路，3磷脂酰肌醇激酶（the phosphatidypnositol3-kinase)/Akt通路，及磷脂酶C-γ（the phosphoppase C-γ plc-γ)通路[3,5,6]。其中MAPK/Erk通路在成骨分化历程中发挥重要的作用[7]。PDGFs/PDGFRs信号通路在成骨类细胞的很多功能中都发挥重要的调控作用，然而该通路对成骨细胞分化作用的影响一直有着争议。很多探讨资料支持PDGF-BB对骨的形成及重塑有积极作用[8,9]，Fierro与他的同事[10]也发现当PDGFRs活性受到抑制时，人类骨髓间充质细胞的成骨作用也受到显著抑制；然而还有一些探讨却表明PDGFs抑制成骨细胞分化[11-13]，如体外实验发现当药理学抑制PDGFRs活性时可以提升细胞内矿化基因的表达并推动基质矿化的发生[14]。临床资料也报道慢性髓细胞性白血病患者(chronicmyeloid leukemia CML)在长期服用PDGFRs抑制剂药物时，体内骨量增加[13,14]。Tokunaga等人[15]在小鼠间充质干细胞中敲除PDGFR-β基因后发现该细胞碱性磷酸酶活性显著增高，矿化标记基因表达量也上升，提示该细胞的成骨分化能力大大增强；然而最近一项利用AG-1296抑制PDGFR活性的探讨结果却显示PDGFR信号通路对人类间充质干细胞的成骨分化历程几乎不产生影响[16]。综上所述，目前PDGFR信号通路与成骨分化历程的联系还不明确，该通路调控成骨分化的机制更是知之甚少。在本探讨中，我们首先采取酪氨酸磷酸化抑制剂AG-1295在MC3T3-E1细胞中特异性抑制PDGFR-β，通过测定细胞碱性磷酸酶活性、茜素红染色检测矿化结节及RT-PCR测定矿化标记基因表达量的实验来揭示PDGFR-β通路对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，其次又采取Western-blot的策略检测PDGFR-β通路是否通过Erk1/2通路来调控成骨分化历程。第一章PDGFRs抑制剂AG-1295对MC3T3-E1矿化表型的影响目的：检测PDGFR-β特异性抑制剂AG-1295对MC3T3-E1成骨分化的影响策略：用PDGFR-β特异性抑制剂AG-1295作用于成骨诱导中的MC3T3-E1细胞，在指定的时间内检测细胞内的碱性磷酸酶活性，茜素红染色观察矿化结节的形成情况，RT-PCR检测矿化标记基因的表达情况。结果：酪氨酸磷酸化抑制剂AG-1295使得MC3T3-E1细胞在成骨分化前期碱性磷酸酶活性水平升高，后期推动基质矿化，并且大多数矿化标记基因的表达水平均上升。结论：PDGFRs抑制剂AG-1295增强MC3T3-E1矿化表型，即PDGFR-β通路与MC3T3-E1细胞成骨分化负相关。第二章PDGFR-β-Erk1/2负调控MC3T3-E1细胞基质矿化目的：检测PDGFR-β通路是否通过Erk1/2通路调控MC3T3-E1细胞基质矿化策略：收集诱导分化2天、10天的MC3T3-E1细胞，提取总蛋白，Western-blot检测AG-1295对Erk1/2表达量及其磷酸化水平的影响。结果：AG-1295对Erk1/2表达量没有影响，但是在第10天，与正常诱导组相比，20μmol/LAG-1295抑制MC3T3-E1细胞的Erk1/2磷酸化水平。结论：PDGFR-β通过Erk1/2负调控MC3T3-E1细胞基质矿化。关键词：PDGFRs论文PDGFR-β论文AG-1295论文成骨诱导论文基质矿化论文PDGF-β论文AG-1295论文成骨分化论文Erk1/2论文磷酸化论文
导师介绍4-5
目录5-7
摘要7-9
ABSTRACT9-12
主要符号表12-13
前言13-23
1 概述13
2 PDGF/ PDGFR 信号通路13-20
2.1 PDGFs/ PDGFRs 概述13-14
2.2 PDGF 的基因定位及蛋白表达14-15
2.3 PDGF 受体15-16
2.4 PDGF 参与的信号转导通路16-18
2.5 PDGFs/ PDGFRs 通路探讨策略18-20
2.6 PDGFR 信号通路的负调控20
3 PDGFs/ PDGFRs 信号通路对成骨分化的影响20-21
4 Erk1/2 的结构特点及激活机制21-22
5 Erk1/2 通路在成骨分化历程中的作用22-23
第一章 PDGFRs 抑制剂 AG-1295 推动 MC3T3-E1 矿化23-35
1 材料与策略25-30
1.1 材料25
1.2 策略25-30
2 结果30-33
2.1 碱性磷酸酶活性测定结果30-31
2.2 茜素红染色结果31-32
2.3 实时荧光定量 PCR 检测结果32-33
3 讨论33-34
4 小结34-35
第二章 PDGFR-β-Erk1/2 负调控 MC3T3-E1 细胞基质矿化35-44
1 材料与策略36-41
1.1 材料36-37
1.2 策略37-41
2 结果41
3 讨论41-42
4 小结42-44