简论门控硫化氢参和异源性慢性应激诱发内脏痛分子机制

摘要：探讨背景硫化氢（H_2S）在哺乳动物体内作为一种神经调制因子发挥着重要的作用，但其是否在内脏痛中也起着调制作用目前还鲜有报道。本探讨的设计正是基于探究内源性硫化氢合酶胱硫醚β-合成酶（CBS）和胱硫醚γ-裂解酶（CSE）在一种已被验证过的大鼠内脏痛觉过敏模型中的作用。实验策略1.利用三种不同的应激策略（冷束缚、强迫游泳、孤岛）对6~8周龄SD雄性大鼠进行9天异源性慢性应激（HIS）以而诱导大鼠的结肠慢性痛过敏模型。运用腹部撤回反射评分（AWR score）的策略来评测HIS大鼠的痛行为反应。2.结肠管壁注射荧光素（DiI）来标记结肠特异性背根节（DRG）神经元，运用全细胞膜片钳策略探讨HIS大鼠中肠相关DRG神经元兴奋性及电压依赖型钠通道的变化特性。3.运用Western Blotting策略检测HIS模型大鼠中胸腰段肠相关DRG神经元中硫化氢合酶CBS和CSE及其电压门控型钠通道亚型的蛋白表达情况。结果1. HIS能够显著增加大鼠结肠扩张的内脏运动反应，并且这一现象是与肠相关DRG神经元内硫化氢合酶CBS的表达上调相关联的。2.对大鼠全身性给予硫化氢合酶CBS的抑制剂AOAA，发现其能够显著的降低HIS处理后的腹部撤回反应的评分。而作为对照，AOAA并不能够对正常大鼠的腹部撤回反应的评分产生作用。3.采取电生理膜片钳技术对肠特异性DRG神经元细胞进行探讨后发现，AOAA能够翻转HIS引起的肠特异性DRG神经元细胞电压门控型钠通道的电流密度的增大。4.为了进一步确认CBS-H_2S信号通路在HIS诱导的内脏痛觉过敏模型中发挥的作用，硫氢化钠被用来模拟CBS产生的硫化氢。结果发现NaHS能够显著的增加正常大鼠肠特异性DRG神经元的兴奋性以及电压门控型钠通道的电流密度。5.用western blotting的策略进行检测后发现，AOAA能够显著翻转HIS引起的肠相关DRG神经元的电压门控型钠通道亚型NaV1.7和NaV1.8表达的上调。结论我们的探讨结果表明，内源性硫化氢合酶CBS表达的上调可能在大鼠内脏痛觉过敏历程中（这种内脏痛觉过敏可能是由于电压门控型钠通道的敏化所造成）发挥着重要作用。由此，本探讨在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制，以而可能为慢性内脏痛提供更为有效的治疗靶点。关键词：肠易激综合症论文内脏痛论文背根神经节论文硫化氢论文电压门控型钠通道论文

中文摘要4-6

Abstract6-10

第一章 引言10-12

第二章 材料与策略12-21

2.1 实验对象12

2.2 异源性慢性应激（Heterotypic intermittent stress，HIS）模型的建立12-13

2.2.1 实验仪器12

2.2.2 造模策略12-13

2.3 腹壁撤回反射(Abdominal withdrawal reflex，AWR) 评分检测痛阈13

2.3.1 实验仪器13

2.3.2 实验策略13

2.4 Western Blotting 检测蛋白表达13-15

2.4.1 实验试剂13-14

2.4.2 实验仪器14

2.4.3 实验策略14-15

2.5 急性分离 DRG 神经元和全细胞膜片钳实验15-21

2.5.1 实验试剂15-16

2.5.2 实验仪器16

2.5.3 荧光染料 DiI 标记肠相关 DRG 神经元16-17

2.5.4 急性分离 DRG 神经元17

2.5.5 拉制玻璃微电极17-18

2.5.6 全细胞膜片钳记录18-19

2.5.7 神经元兴奋性记录19-21

第三章 实验结果21-31

3.1 CBS 的表达上调参与异源性慢性应激（Heterotypic intermittent stress, HIS）诱导大鼠内脏痛觉过敏21-23

3.1.1 HIS 显著增加大鼠对结直肠扩张的敏感性21-22

3.1.2 HIS 显著上调肠相关 DRG 神经元细胞中 CBS 蛋白的表达22-23

3.2 CBS 的抑制剂 AOAA 能够翻转 HIS 诱导的痛觉过敏23-24

3.3 CBS 的抑制剂 AOAA 能够翻转肠特异性 DRG 神经元中电压门控钠电流的电流密度的增加24-26

3.4 硫化氢的供体 NaHS 能够增加肠特异性 DRG 神经元细胞的电压门控钠通道的电流密度和肠特异性 DRG 神经元细胞的兴奋性26-29

3.5 CBS 的抑制剂 AOAA 能够翻转肠相关 DRG 神经元中 NaV1.7 和 NaV1.8的表达上调29-31

第四章 讨论31-34