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摘要：MicroRNAs (miRNAs)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小、RNA分子,大约由21—25个核苷酸组成,其本身不具有开放阅读框架(ORF)及蛋白质编码基因,有独特的特点序列,主要在转录后水平调控基因的表达。Lee等在探讨线虫C.elegans遗传发育筛选中首次发现miRNA pn-4; Reinhart等发现第二个非编码rniRNA let-7。miRNAs在生物体的物质代谢、细胞周期、细胞分化、凋亡、个体形态的形成和发育等一系列重要生命活动的调控历程中扮演着重要角色。迄今,已发现多个发挥原癌基因或抑瘤基因作用的miRNAs,女let-7、miR-21、miR-17、miR-143和miR-145、miR-372和miR-373以及miR-26a等,它们通过调控下游靶基因的转录和翻译参与肿瘤的演进历程。探讨表明,50%以上的miRNAs定位在肿瘤相关的基因组区域(cancer associated genomic regions, CAGR),包括LOH区、染色体扩增区及脆性位点等,其表达水平在许多肿瘤中发生转变,可能起到原癌基因或肿瘤抑制基因的作用,由此也将此类miRNA称作oncomirs,在肿瘤发生、进展及转移等历程中发挥重要作用。miR-155位于人类21号染色体上,B-cell integration cluster (Bic)基因的第三个外显子内,此基因不含开放阅读框,过表达可推动细胞异常增殖；miR-155表达受Bic的转录水平和miRNA加工等调控。探讨表明,miR-155在造血细胞生成、免疫反应和炎症反应中发挥效应：miR-155在许多常见肿瘤(如淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、胰腺癌等)中表达上调。一些探讨显示,miR-155与肿瘤发生、转移或预后等相关,被认为是癌性微小RNA(oncomiR);比如在小鼠体内转基因过表达miR-155可诱发淋巴瘤、白血病和骨髓瘤；miR-155可推动乳腺癌、肺癌和肝癌细胞的增殖；此外,miR-155可增强乳腺癌细胞的抗凋亡能力和化疗耐药性。鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是指发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤。发病年龄大多为中年人,亦有青少年患病者。中国的广东、广西、福建、湖南等地为高发区。NPC恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移。探讨表明,环境因素和EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染在致癌历程中均可能起十分重要的作用；最近,Sengupta等利用高度精确和敏感的基因表达谱发现了8个在激光捕获显微切割(1aser-capture microdissection, LCM)后的NPC组织和正常鼻咽部上皮组织中具有显著性表达差别的miRNA,即表达下调的miR-29c、 miR-34b、miR-34c、miR-212、miR-216和miR-217以及表达上调的miR-151和miR-192。此外,他们还通过生物信息学预测和实验验证,确定了miR-29c的靶基因为编码细胞外基质蛋白(extraceilular matrix proteins),包括多种胶原蛋白(collagens)(?)laminin y1,其与NPC侵袭转移密切相关。miR-155在NPC组织中表达上调,那么miR-155是否与NPC发生进展及转移等相关,目前尚未见报道。由此,miR-155表达失调在NPC发生进展及转移中扮演何种角色,miR-155是否作为NPC一个oncomir等一系列不足都值得我们深入探讨。基于miR-155探讨近况及其在明确NPC癌变早期的分子机制中的潜在作用,本课题的探讨目的为：明确miR-155在NPC细胞株和组织中的表达谱及其对NPC细胞生物学行为的影响,包括增殖、迁移和EMT等。我们通过上调和下调niR-155的表达水平明确其对NPC细胞生物学行为的影响,随后进行下游靶基因的筛选和验证,初步探讨miR-155在NPC如上生物学行为中所扮演的角色及其机制,这将为深入理解NPC发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定论述基础,为此本课题进行了如下探讨：策略：1.NPC细胞株和组织标本中miR-155的表达谱采取qRT-PCR检测CNE1、CNE2、5-8F、6-10B、C666-1、HNE1、SUNE1和HONE18种NPC细胞株miR-155表达谱(以永生化鼻咽上皮细胞株NP69作为对照)。收集NPC组织标本15例和慢性鼻咽炎症组织标本10例,运用qRT-PCR检测miR-155的表达谱,结果浅析运用2-△△Ct策略进行比较。2.建立稳定过表达miR-155的NPC细胞株利用慢病毒表达载体pLenti-miR-155生产携带miR-155的慢病毒,收集病毒上清分别感染NPC细胞株CNE1、CNE2、HONE1和SUNE1,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测EGFP表达以观察感染情况,若感染效率低于90%,运用流式细胞仪分选EGFP+细胞,大量扩增细胞并保种；提取RNA,运用qRT-PCR检测携带有miR-155转基因的NPC细胞株中miR-155表达水平。3.过表达miR-155对NPC细胞增殖、迁移及EMT的影响CCK8实验、平板克隆和细胞周期检测细胞增殖能力转变；Transwell小室检测细胞迁移能力转变,qRT-PCR、Western blot及免疫荧光(ICC)检测EMT相关基因E-cadherin、α-catenin、Fibronectin、N-caherin及vimentin表达水平的变化。4.利用miR155阻遏物下调NPC细胞中内源性niR-155表达水平以进一步明确miR-155的如上功能利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR155阻遏物(miR155inhibitors)转染至HONE1和SUNE1中,48h收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测niR-155表达以评价抑制效果,CCK8和Transwell小室分别评价下调内源性miR-155表达水平对细胞增殖和迁移能力的影响,Western blot检测EMT相关基因表达。结果：1.NPC细胞株和组织标本中miR-155的表达谱采取qRT-PCR检测NPC细胞株CNE1、CNE2、5-8F、6-10B、C666-1、HNE1、 SUNE1和HONE1中miR-155表达情况(以NP69为对照)。结果显示,miR-155在以上8株NPC细胞株中的表达水平均显著高于NP69(图1-1A),其中以CNE1最高,HONE1次之。qRT-PCR检测15例NPC组织和10例鼻咽炎症组织中miR-155表达,结果显示两者间无显著差别(图1-1B),这可能是因为我们所选用的正常对照为慢性炎组织标本,而miR-155已被证实在炎性淋巴细胞中高表达,因而干扰了miR-155的检测。2.建立稳定过表达miR-155的NPC细胞株慢病毒载体pLenti-miR-155经测序鉴定,明确序列正确(图2-1)；接着利用携带miR-155的慢病毒感染NPC细胞株,48-72h后于倒置荧光显微镜下通过检测EGFP表达确认感染成功,随后提取RNA, qRT-PCR检测证实携带有miR-155转基因的NPC细胞株中miR-155表达正常(表2-1和图2-4),差别均具有统计学作用(P0.001),预示成功构建稳定过表达miR-155的NPC细胞株。3.过表达miR-155对NPC细胞增殖、迁移及EMT的影响。3.1增殖能力CCK8实验、平板克隆和细胞周期等实验结果均表明过表达miR-155可推动NPC细胞增殖(图2-5、图2-6和图2-7)。3.2迁移能力及EMT相关基因的变化Transwell实验结果显示：过表达miR-155推动了HONE1和CNE2体外迁移(表2-2和图2-8)。EMT相关基因的变化：qRT-PCR结果显示,在CNE2和HONE1中过表达miR-155后,上皮细胞标志物E-cadherin和a-catenin表达水平下降(图2-9),差别具有统计学作用(P0.05),而间质细胞标志物N-cadherin和vimentin表达水平升高(图2-9),前者差别有统计学作用(P0.05),后者差别无统计学作用(P=0.212)。Western blot结果：CNE2和HONE1过表达miR-155后E-cadherin和α-catenin表达水平下降,而间质细胞标志物Fibronectin口vimentin表达水平升高(图2-10)。ICC结果：CNE2、HONE1过表达miR-155后,E-cadherin(?)α-catenin表达下降,Fibronectin、N-caherin及vimentin表达水平升高,与Western blot结果一致,(图2-11)上皮-间充质转化(EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学历程,EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学历程。在EMT发生历程中常会导致上皮细胞标志物E-cadherin、 α-catenin等表达水平下调,造成细胞间粘附能力降低,而间质细胞标记物Fibronectin、N-caherin(?)vimentin表达水平升高,则导致细胞迁移能力增强。4.利用miR155阻遏物下调NPC细胞中内源性niR-155表达对细胞增殖、迁移和EMT相关基因表达的影响4.1miR155inhibitors下调NPC细胞中内源性miR-155表达利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR155阻遏物(miRl55inhibitors)导入HONE1和SUNE1中,48h收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测miR-155表达,结果显示,内源性miR-155的抑制效率达80%左右(图2-12)。4.2细胞增殖能力变化CCK8生长曲线结果显示,HONE1和SUNE1中内源性miR-155表达下调后,细胞增殖能力下降(图2-13)。4.3细胞迁移能力及EMT相关基因水平的变化Transwell小室实验：HONE1和SUNE1中内源性miR-155表达下调后,细胞迁移能力减弱(表2-8和图2-14)。Western blot结果：下调HONE1和SUNE1中miR-155表达,导致E-cadherin表达上调和vimentin表达下调(图2-15)。结论：miR-155可推动NPC细胞体外增殖和迁移能力,且能推动EMT发生。关键词：NPC论文miR-155论文细胞增殖论文细胞迁移论文EMT论文
摘要3-9
ABSTRACT9-15
前言15-25