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摘要：目的：非酒精性脂肪性肝病（non-alcohopc fatty pver disease, NAFLD）是和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤。随着人们膳食结构及生活方式的转变，全球NAFLD患病率呈现上升走势，其疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌。非酒精性脂肪性肝纤维化是疾病进展至肝硬化、肝癌和终末期肝病必经的病理阶段，肝纤维化病变能否制约或逆转在很大程度上影响患者的预后。目前临床缺乏高效、无显著毒副作用的抗肝纤维化西药，中药因其多组分、多途径、多靶点抗肝纤维化作用而日益引起学者关注。已有探讨表明，丹参、桃仁、绞股兰等中药均有一定的抗肝纤维作用，由以上三味中药为主组成的扶正化瘀复方具有良好的抗慢性乙型肝炎肝纤维化的作用，但该中药复方对非酒精性脂肪性肝纤维化的作用及作用机制尚不明确。uPA/PAI-1是调节细胞外基质降解的主要酶系，它们的表达失衡直接影响细胞外基质沉积，进而影响肝纤维化的发生与进展。本探讨以蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine andchopne deficient, MCD）饮食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型，扶正化瘀复方或联合血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）激动剂、抑制剂进行干预实验，旨在探明uPA/PAI-1在非酒精性脂肪性肝纤维化进展中的作用及扶正化瘀复方和/或HO-1激动剂对uPA/PAI-1表达的影响及作用机制。策略：选用清洁级8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠（中国医学科学院实验动物探讨所），所有小鼠普通饲料喂养1周后随机分为7组，以MCD饮食喂养8周建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型，同时分别运用扶正化瘀复方、HO-1激动剂血晶素、抑制剂锌原卟啉、扶正化瘀复方联合HO-1激动剂或抑制剂进行干预实验，以蛋氨酸-胆碱充足饮食设立对照组。喂养8周造模结束后，深度麻醉下取血，4℃离心分离血清，留取部分肝组织以4％中性甲醛固定，备做病理切片，其余肝组织用液氮快速冷冻后置于-80oC冰箱保存，备提取蛋白、mRNA。1观察实验小鼠一般情况：处死小鼠前观察其精神状态、毛发，并称量体重及肝湿重，计算肝指数（肝湿重/体重×100％）。2血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotranerase, ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotranerase, AST）采取日本Olympus AU5400全自动生化浅析仪酶法测定。3肝组织切片采取苏木精-伊红（haematoxypn and eosin, HE）染色观察肝细胞脂肪变、炎症程度；Masson染色观察肝纤维化程度。4肝组织纤维化相关基因检测：采取逆转录聚合酶链反应（reversetranscription polymerase chain reaction, RT-PCR）、Western blot及免疫组织化学检测肝组织HO-1、转化生长因子β1（tranorming growth factor beta1,TGF-β1）、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase type plainogen activator,uPA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plainogen activator inhibitor-1, PAI-1）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）mRNA及蛋白的表达。5实验结果采取SPSS13.0单因素方差浅析进行统计学处理，组间比较采取Student-Newman-Keuls浅析，P0.05为差别有统计学作用。结果：1实验动物一般情况：对照组小鼠活泼、毛发有光泽，体重、肝湿重随造模时间延长逐渐增加。各干预组小鼠精神差，体重、肝湿重均显著低于对照组，尤以HO-1抑制剂组下降最为显著（P值均0.05），但各干预组小鼠体重及肝湿重之间无显著统计学差别。各组实验小鼠肝指数亦无显著统计学差别（P0.05）。2血清ALT、AST水平：血清ALT和AST水平依次为：对照组扶正化瘀复方联合HO-1激动剂组扶正化瘀复方组HO-1激动剂组扶正化瘀复方联合HO-1抑制剂组模型组HO-1抑制剂组，各组间差别具有统计学作用（P0.05）。3肝组织病理学变化：对照组小鼠肝小叶结构正常，肝板走行整齐；模型组小鼠肝组织出现中至重度肝细胞脂肪变性，呈现大泡性为主的脂肪变，以腺泡3带为著，伴有点、灶状肝细胞坏死、炎细胞浸润、轻度汇管区纤维组织增生及窦周纤维化；HO-1激动剂组、扶正化瘀复方组及扶正化瘀复方联合HO-1激动剂组肝细胞脂肪变及炎症活动度较模型组均显著减轻，尤以扶正化瘀复方联合HO-1激动剂组改善显著；HO-1抑制剂组肝组织炎症及纤维化程度较模型组加重，扶正化瘀复方联合HO-1抑制剂组肝细胞脂肪变及炎症程度较HO-1抑制剂组减轻。4肝组织HO-1、TGF-β1、uPA、PAI-1、MMP-9和TIMP-1mRNA及蛋白表达情况：伴随血清ALT、AST水平升高，模型组肝组织纤维化相关基因TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9、TIMP-1及HO-1mRNA表达较对照组显著升高。扶正化瘀复方组HO-1、TGF-β1、PAI-1、TIMP-1mRNA及蛋白表达量较模型组显著降低（P0.05），而uPA、MMP-9表达量呈相反走势（P0.05）；扶正化瘀复方联合HO-1激动剂组伴随HO-1mRNA及蛋白表达上调，PAI-1、TGF-β1、TIMP-1表达进一步减弱（P0.05），uPA、MMP-9表达进一步增强（P0.05）；与扶正化瘀复方组比较，扶正化瘀复方联合HO-1抑制剂组uPA、MMP-9表达下调，TGF-β1、PAI-1、TIMP-1表达升高（P0.05）。各相关基因蛋白表达走势与mRNA一致。结论：1在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠模型中,TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9及TIMP-1等纤维化相关基因在肝纤维化的发生进展中具有重要作用。2扶正化瘀复方通过抑制氧化应激及脂质过氧化反应、抑制肝星状细胞活化、抑制炎症及纤维化相关基因表达，多环节、多途径阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生与进展。3扶正化瘀复方联合HO-1激动剂能够协同推动抗肝纤维化相关细胞因子表达上调、促纤维化因子表达下调，有效阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。关键词：扶正化瘀复方论文非酒精性脂肪性肝纤维化论文转化生长因子β1论文纤溶酶原激活物抑制剂-1论文尿激酶型纤溶酶原激活物论文基质金属蛋白酶-9论文基质金属蛋白酶抑制剂-1论文
摘要4-7
ABSTRACT7-11
前言11
材料与策略11-19
结果19-23
附图23-27
附表27-31
讨论31-34
结论34-35